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标题: 关于MSCs的诱导内皮和成骨诱导 [打印本页]

作者: kgx1986 时间: 2011-10-18 13:22 标题: 关于MSCs的诱导内皮和成骨诱导

本帖最后由 kgx1986 于 2011-10-18 13:32 编辑 " r5 L" B& h4 W: f
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   我现在在做MSCs的诱导内皮和成骨诱导，因为实验室没有人做过，师兄师姐都毕业了，所以全靠自己一个人摸索，恳请大家帮帮忙，给予我一些指导，也能让有同样困惑的同学得到启发，同时也活跃论坛氛围。
首先，我做向内皮细胞诱导的困惑——细胞接种密度控制在多少比较合适？诱导过程中细胞或不断生长会不会造成密度过大？密度过大导致细胞叠加会不会严重影响诱导效果？下面是我诱导10天的图片，有些地方细胞细胞密集，形态都挤的变形了（之前细胞很均匀，典型的长梭形）。如图1 G8 _+ c- ^" p3 k* M2 p7 M  V
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我做成骨诱导的过程中，发现细胞在诱导过程中会有死亡，并且会出现一些黑色的东西，并且用PBS洗不掉，我觉得应该是细胞死亡后细胞核一类的东西。上次做诱导染完色好像效果很不理想，论坛里其他老师说应该诱导不成功，这次诱导了十多天了，情况比上次好点，但还是有细胞死亡和黑色的东西。不知道各位老师诱导时会不会出现这种情况，希望给予指点，不胜感激！所说情况如图

作者: meister 时间: 2011-10-18 14:16

得染色鉴别

作者: kgx1986 时间: 2011-10-19 07:52

大家关注一下吧，难道没有人做这方面的工作？内皮分化诱导人做得比较少还可以理解，但成骨诱导应该做间充质的很多人都要做的吧，试验正在进行，恳请大家指导呀！！

作者: dragon513 时间: 2011-10-20 09:55

这个密度恐怕也太高了吧

作者: kgx1986 时间: 2011-10-20 16:37

回复 dragon513 的帖子9 k- I/ x6 x% \# S. W" U

诱导开始的时候，密度很好，诱导过程中，细胞还在继续增殖，我也在纳闷，不是细胞生长过程中有接触抑制吗？为什么还会长的这么多呀？看来长不好烦心，长得太好也烦心。

作者: 踏雪寻梅 时间: 2011-10-20 20:36

我想知道楼主诱导内皮细胞用的什么配方？

作者: dragon513 时间: 2011-10-21 09:00

回复 kgx1986 的帖子

我记得我做成骨诱导的时候细胞会发生聚集，形态变成多角形，不大好看了。成内皮分化没做过，但诱导成脂和成骨时细胞好象没有无限制的增殖呀。

作者: kgx1986 时间: 2011-10-21 13:31

回复踏雪寻梅的帖子) R: _; Z P( `& Z9 y4 o0 C+ d

最简单的基础培养基加诱导因子，VEGF+bFGF

作者: kgx1986 时间: 2011-10-21 13:33

回复 dragon513 的帖子
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现在我在想，是不是因为我加了诱导剂才致使细胞形态发生改变了？！

作者: 可怜的孩子 时间: 2011-10-21 23:11

你是哪里的？用的是什么种属的细胞？

作者: kgx1986 时间: 2011-10-22 19:37

回复可怜的孩子的帖子8 Z2 [8 i7 v! h% L2 ?9 A. c
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我是北京的，细胞来源为兔子骨髓间充质干细胞

作者: menghy 时间: 2011-10-22 21:34

个人觉得楼主可以将你的实验方案列的更详细些，比如来源，细胞浓度，时间，诱导培养基成分等。0 [5 x# F( r. D+ a& C7 f6 r3 C, _9 C
成骨诱导一般不加EGF和VEGF，14天左右，你可以染色监督下，大部分文献报道的诱导方案成分都差不多。
接触性抑制是有的，但是不可能完全的达到抑制，只是增殖的时间和数量降低了一些而已。

作者: 可怜的孩子 时间: 2011-10-23 00:38

回复 kgx1986 的帖子( [( J6 ~4 ^; ?0 ?
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上海九院骨科实验室有个组专门做这个，成骨成血管双向诱导分化，复合后用于骨再生。你可以找他们文章看看。我认为首先确定你的细胞是否正确，确定是相对较纯的骨髓间充质。成血管诱导可以使用ECM内皮细胞基础培养基（比较贵）加不同浓度VEGF进行诱导，CD31，CD34免疫组化检测。成骨就是用普通DX诱导液，7天ALP染色，14-21天钙结节染色（硝酸银或茜素红）。钙结节染色时不用传代了，即使长得很满，可以隔天换液。

作者: luoziwei 时间: 2011-10-23 13:24

鄙人觉得成骨诱导细胞变黑属正常现象，那是钙化开始的特征

作者: kgx1986 时间: 2011-10-23 15:54

回复 luoziwei 的帖子

多谢指导。如果确实如此，那就太好了。

作者: luoziwei 时间: 2011-10-24 15:42

回复 kgx1986 的帖子+ h$ W' D8 E! q3 {5 Z
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一般在诱导15天后，去掉培养液并在显微镜下观察，你会发现除了黑点外，局部还有一些发亮的圆斑点，就像基因转化生长的蓝白斑一样，那就是钙结节。我有一个图，你可以看看。

作者: luoziwei 时间: 2011-10-24 15:49

回复 kgx1986 的帖子
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上传不了图片！！

作者: kgx1986 时间: 2011-10-24 21:02

回复 luoziwei 的帖子5 v/ h3 v: a7 I W' V4 l; |

谢谢你的指导，如果可以的话，可以把图片发到我的邮箱kmk1986@163.com,谢谢!

作者: luckywen 时间: 2011-10-25 00:00

请问你选择的是第几代进行内皮诱导的呢？诱导起始密度如何？添加因子的量？看照片感觉密度过高,还有必要加bFGF吗？

作者: kgx1986 时间: 2011-10-25 08:41

回复 luckywen 的帖子
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首先谢谢你参与讨论。; z; E+ m+ [0 p7 n
我用的是P3代细胞，起始密度是1X105个，因子量VEGF10ng/ml,bFGF4ng/ml，从诱导开始，细胞还是在增殖，我现在觉得这种情况不仅仅是细胞密度大的问题，细胞形态也发生了改变，但不像其他人低密度诱导时细胞稀疏，每个细胞之间留有空隙！？我的培养板中，高密度区周边的细胞相对以前，核浆比例增大，这种情况在文献上也有出现。; s7 v# k7 |/ L: z8 D
bFGF的作用不仅仅是促进细胞增殖吧，在诱导体系中还有其他作用，我觉得加bFGF还是需要的。

作者: luckywen 时间: 2011-10-26 13:05

你好，不知道你的实验现在怎么样了，有文献说诱导时细胞密度要低，一般向内皮分化就用这两种因子，调整一下浓度.

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