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标题: Trizol提取RNA比值偏低 [打印本页]

作者: dmmwhb 时间: 2011-11-4 08:40 标题: Trizol提取RNA比值偏低

最近用上海生工的Trizol提取总RNA，按照说明书一步一步来都做好几遍了
最后测得的比值都在1.3-1.4，很不好
最后一步我是室温干燥5min，加30ulDEPC水吹打几下就测0D值了，这步有问题吗？要不要等一段时间让RNA溶解？
请高人指点问题可能处在哪里？

作者: wangzhiqi86 时间: 2011-11-4 08:46

我有很多次测的也是1.3-1.4，也能做的，只是不纯而已。加DEPC水溶解的时候，里面可以加一点RNA Inhibitor（0.1ul/10ul DEPC水），防止RNA降解。由于RNA是大分子，一般需要室温溶解半个小时之后，也可以4℃溶解过夜（不建议），再测OD。

作者: langziforever 时间: 2011-11-4 08:50

回复 dmmwhb 的帖子" x# N: h+ M r B% y0 W" |* V
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我觉得测的比值低，和你RNA是否完全溶解没有太大关系，主要还是有其他的污染，如果是260/280说明可能有蛋白质的残留，如果260/230的话就是盐离子或多糖这些的残留，所以，估计原因还是在于你前面的操作步骤，TriZol是不是量足够，后续的抽提步骤是不是彻底，每次吸液不要有残留，注意下这些细节。另外，我个人觉得Trizol的质量也很重要，我没有用过生工的，但以前用invitrogen的不同批次提RNA都会有不同的效果，所以，还是建议你注意一下！

作者: dahui 时间: 2011-11-4 09:19

对于这个问题，我也纠结了半年，每次测的260/280比值都不稳定，建议以下几点：: p6 I# q2 U2 I/ e* i" k0 }; k
一、从离心管和枪头的灭菌、DEPC水和75%乙醇、氯仿和异丙醇的无菌程度及成品的试剂等级来考虑，做到没有纰漏；6 z; H; S; c- H& J7 Z. N/ h

二、组织样品来源，以及前处理方法及处理过程中的处理，主要就是冷冻的程度与速度决定了内源性RNase讲解RNA问题，另外就是Trizol添加量问题，如果RNA的最终量要求不高，建议组织的量尽量小；

三、加完氯仿后颠倒的剧烈程度，以及加完异丙醇后混匀要尽量轻柔(包括加液时的液流速度)，另外更重要的就是吸取上清时不要贪多，建议400微升就可以了，另外就是离心管从离心机拿出时顺着其倾斜的角度取出，不要直立放架子上了，直接上枪吸取；. K: ^. s+ s5 O

四、后面75%乙醇洗涤时可以洗两次，并且弃乙醇时，倾倒上清后再稍离心，用10微升的枪吸取干净，这样可以加快乙醇挥发的速度；
另外，抽取过程中时刻观察离心后管底的RNA状态(一般情况下是可见，透明稍嫌白色)，并且在自己找原因的时候，试剂、耗材，包括操作手法做几个平行对比，RNA干燥时不用太久，注意观察，加DEPC水后，理论上讲是“入口即化”这种，不用等很长时间，但如果沉淀确实多，可以用枪稍作混匀或64读加热助溶。, O) V# b/ d/ b: C- D2 ?$ m: s

——以上说法与建议仅供参考，欢迎讨论交流。

作者: dahui 时间: 2011-11-4 09:23

再补充一点，建议做一个电泳看看，RNA有没有降解，上样钱，上样的RNA和buffer在60读共孵育10min，为了是考察有没有污染。

作者: zxcv12345 时间: 2011-11-6 07:35

回复 dmmwhb 的帖子0 Q2 s- i) `! g( w N, w
7 t/ k, o0 E# `' d) A- ]8 x. y7 z
比值低，主要是蛋白等污染物较多造成的。在取上清时，不要吸取中间层

作者: dmmwhb 时间: 2011-11-6 11:16

回复 dahui 的帖子
+ Z, |4 H8 e7 u( I+ S# Z
非常感谢你回复，我用的氯仿、异丙醇、无水乙醇都有一年多了，这个还能用吗

作者: dmmwhb 时间: 2011-11-6 11:17

回复 langziforever 的帖子; Q( h4 L5 h4 `. z) x

谢谢，测比值时一般稀释多少倍比较好啊

作者: dmmwhb 时间: 2011-11-6 11:18

回复 wangzhiqi86 的帖子

谢谢哈，30min室温溶解RNA会不会降解厉害呀？

作者: dahui 时间: 2011-11-6 13:26

回复 dmmwhb 的帖子9 \9 J! Q; e" }0 ~9 V
, S; H5 m U4 d: }# j0 { w
大哥，这几个东西好像都不贵吧，除了氯仿是管制的意外，其他的都好买呀，一年多了？我劝您还是换一下吧，另外如果是别人用剩的就更要换了，我们通常都是抽提RNA的有自己一套东西和试剂，从来不和其他实验交叉使用

作者: wangzhiqi86 时间: 2011-11-6 14:23

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这么短的时间是不会的，我经常这样，测出来的A260/A280不会超过2，大概1.8左右吧！

作者: langziforever 时间: 2011-11-6 18:04

回复 dmmwhb 的帖子( _; W3 W7 I) c& [
6 k: E/ Q) n5 I# M1 g: D
那就取决于你RNA的浓度了！把它稀释到你测量仪器的范围内就可以了，我一般会稀释稀释过50倍、100倍、200倍，然后终浓度在10ug/ml左右比较好！但主要还是看你测量仪器的精确范围了！太浓了会使操作时的误差增大，而且损失样品，太稀了测不准，受杂志影响很大！

作者: 827914734 时间: 2011-11-8 17:12

我认为比值低应该还是污染，吸上清时不仅要注意不要吸到中间层，而且尽量不要重复吸，只吸一次就可。
另外，干燥时间较短，我一般都20分钟左右，加DEPC水后，不需要等太长时间

作者: cronos0910 时间: 2011-11-10 03:22

75% 乙醇那步没做好, 比值才会那么低, 回溶的步骤我建议在4度10mins

作者: xiaoyurly 时间: 2011-11-10 10:49

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乙醇洗涤后挥发的时间太短了吧，没挥发干净会影响RNA质量的。我们一般都是尽量吸净乙醇残液，甚至用干净的吸水纸吸干，觅一个僻静之地室温挥发15min左右。溶解RNA时60-70°水浴助溶。

作者: dmmwhb 时间: 2011-11-17 14:52

回复 xiaoyurly 的帖子0 Z: I) D3 W7 E" T+ }, u* s; n

先谢谢你的回复，说明书上说的只晾5-10min，久了不容易溶解，还有就是在室温久了容易降解啊，不过我没试过这个，下次还是试试晾干久一点

作者: ilovelife 时间: 2011-11-17 20:48

同意dahui 的建议。大概3点建议：7 o: n' _) D: Z0 c6 O1 k5 o/ B/ [
1. 可以用75%乙醇洗两次，量用的大一些，上下颠倒几次，目的是把残留在管壁和RNA沉淀表面的盐去掉。最后一步去掉75%乙醇后，稍加离心，用10ul枪头吸去微量残液，室温晾干时切忌量得太干，否则及难容，观察到确实没有液体了，从最边缘开始有开始变白的迹象就加水溶解。2 g$ e/ l3 z7 f/ X5 N
2.换一批Trizol，氯仿和异丙醇试试，可以先从其他有成功经验的实验室借，用来做对比试验，一次替换一个对比元素，这样容易找原因。9 X: S2 ~0 L( [; A* F5 l' {9 {
3.跑个电泳看RNA是否降解。) d9 k6 U- w- C
祝你很快解决这个问题。

作者: dmmwhb 时间: 2011-11-18 10:04

回复 ilovelife 的帖子+ I8 n. }+ S- \6 r' E+ j9 a

非常感谢ilove的建议

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