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标题: 流式求助 [打印本页]

作者: 花饶然 时间: 2011-11-7 11:39 标题: 流式求助

用血清封闭液的话，是在标记前还是标记后啊？

作者: wangzhiqi86 时间: 2011-11-7 12:29

流式有很多用途，所以看你是做什么的，免疫荧光是标记前血清封闭

作者: 花饶然 时间: 2011-11-7 13:07

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我做免疫表型的，谢谢

作者: wangzhiqi86 时间: 2011-11-7 13:34

回复花饶然的帖子$ F. O9 h+ k, h; {% O+ }
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细胞流式鉴定表面标志物？那不用血清封闭啊

作者: evial 时间: 2011-11-7 14:09

在上荧光抗体前先用FBS或BSA封闭，冰上15-30分钟，去除非特异性结合。

作者: zerollx 时间: 2011-11-7 20:15

可用可不用，我从没用过

作者: evial 时间: 2011-11-7 21:08

不用？真没见识过这样的，想严谨发文章的同志们不能听信谣言

作者: Tonypan 时间: 2011-11-8 02:40

细胞表面有FcR，会非特的结合抗体的Fc段。所以在流式检测前应该用FcR Blocking Reagent封闭FcR。以减少非特异性结合。+ I3 Y0 ~) w: _( f' A& R
血清封闭也可以起到一定的效果。& ^, E% A, g g+ W: I6 z
尤其是针对稀有细胞的检测，FcR阻断是非常有必要的。3 {3 G, ?* ]. P$ i
高表达的细胞有不做FcR阻断影响不是特别大。

作者: 827914734 时间: 2011-11-8 17:01

我们用流式测细胞表面标记时，一般都是在标记后血清封闭

作者: leisong12 时间: 2011-11-8 19:49

到底有没个标准啊，怎么说什么的都有，流式测免疫表型，如果一抗不带荧光，需要用和二抗（带荧光）相同来源种属的动物血清封闭，这点我可以确定，许多文章都是这样写的。不知道如果一抗是带荧光该怎么封闭啊？一概用牛血清或BSA封闭是不是不够好啊，用FcR Blocking Reagent是不是成本太昂贵了，该怎么办，有没有权威一点的解释？

作者: zz091115 时间: 2011-11-9 10:59

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加抗体之后再封闭你有作用么...封闭就是为了封住非特异性结合位点要么使用抗体前加要么干脆你就别加了这样加你不是浪费么...

作者: zz091115 时间: 2011-11-9 11:04

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个人感觉不是很必要加你做western的话一种抗体对一种抗原当然要封闭来准确定量但是你是做流式鉴定surface markers确定细胞群的话通常你不会只用一个染色就确定用三染甚至更多荧光颜色的话非特异性结合同时发生影响你的结果的概率就很小了如果你想追求非常严谨或是钱多那就另当别论了...

作者: zz091115 时间: 2011-11-9 11:08

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直标一抗我觉得不需要你测定通常都是三种甚至更多的marker 同时发生非特异性结合的概率很低

作者: zz091115 时间: 2011-11-9 11:09

奇怪了为啥我的回复自己看不见

作者: chutu 时间: 2011-11-9 11:48

FcR主要在NK、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞等表达。如果检测的细胞中包括这类细胞，应该先用FcR Blocking Reagent封闭，否则FcR介导的标记抗体吸附会很严重，造成假阳性结果。因为血清中存在大量抗体蛋白，所以可以起到封闭FcR的作用，尤其是同种属的血清。对于其它大多数细胞，表面没有FcR, 但由于表面电荷作用或者其它吸附作用的存在，细胞会非特异地吸附抗体，造成一些弱的染色，用BSA或血清封闭，可以减弱非特异的抗体吸附，这就是封闭的意义。不过实际上非特异的抗体吸附很微弱，封闭不封闭一般情况下可能看不出多大差别，除非很精细的实验

作者: 827914734 时间: 2011-11-9 13:09

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我做的也不是很多，现在主要是沿用师兄师姐的做法，我觉得仅用一抗进行标记时封闭效果有限，而且非特异性结合也可以用同型对照去除吧，我们的封闭是在洗去抗体时进行，个人觉得抗体孵育时间过长也好增加非特异性结合的机会，用血清封闭应该也会减少非特异性结合的机会，当然从这个意义上讲也许标记前封闭效果会好一些。一抗封闭，说有多大效果未必，完全浪费也未必，主要是自己没做过这种对照，不好下定论。我也是新手，还请前辈指教。

作者: zz091115 时间: 2011-11-9 13:48

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各自有各自实验室的习惯这个不好统一让楼主自己去摸索吧...

作者: 细胞海洋 时间: 2011-11-10 00:04

回复 zz091115 的帖子2 d. m6 M3 n |4 h
6 B4 ~0 z4 b. g& s9 \) X
翻页第二页了

作者: leisong12 时间: 2011-11-10 10:56

我觉得可以结合zz091115和chutu两位的观点，实际操作中可以做个预实验，看看一抗标记荧光的封不封闭差别大不大。我们用三色确定细胞群的不多，见过临床上分血细胞是三色标记的。如果只用一种荧光标记的抗体，如分选已知表面标记的肿瘤干细胞，用BSA还是和抗体种属来源相同的血清封闭呢，或者干脆用牛血清封闭，现在也是不知怎么弄才好。

作者: dyg108 时间: 2011-11-10 11:13

本帖最后由 dyg108 于 2011-11-10 11:19 编辑 ! L: A3 P( n6 K( h. o8 i; J5 `* P
: j9 M/ f" W( l! n) `5 i
最好的答案就是按照你试剂的说明书来做。流式细胞术技术非常复杂，不同的试剂，或针对不同抗原的抗体做法是不能统一的，这一点非常重要。如果想做到最好，那么连PBS等一些配备的耗材最好也用说明书上给推荐的产品。
当然，一般BD的产品是没有封闭这一步的，但洗涤所用的PBS里要加有BSA，这样有时候自己配洗液就可以了，不用非买产品推荐的洗液。如果效果不好，那么可以考虑严格使用说明书上的步骤和推荐产品。( \) Z. N( X6 n$ h- Y' {8 k
其实一般情况下不使用BSA可能会使得道指增大，图形不太好看，但结果影响不大。为了严格建议使用BSA，但浓度不用太大。

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