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标题: 警惕支原体污染 [打印本页]

作者: hany2007 时间: 2011-11-10 01:24 标题: 警惕支原体污染

这些日子，我把所有的实验都停下来了，把实验室孵箱里的细胞统统都扔掉了，重新从液氮罐里把细胞复苏，用支原体专杀药物PLASMOCIN处理。1 z+ W6 P# Z b! `) X' P3 R3 g
其实是不得已，真地不得已。我们这个城市里几乎所有实验室的细胞里都有一种小颗粒物质，细胞传代时一旦密度传低，细胞就不容易长起来。我一直很得意自己的细胞状态很好，嘿嘿，培养基都是清澈的。但等到国庆节，我就无法乐观起来了，我用PLKO.1做RNA干扰，转染完毕后，我用puromycin筛选稳转株时，从1ug到8ug的筛选浓度都把细胞给杀死了，puromycin我在五月份专门测过筛选浓度，merck的产品，很强，4ug每毫升就能把未作转染的细胞全部杀死，但低于2ug就无效了。而此次转染后，细胞在1ug就死光了，细胞培养瓶里漂浮着许多黑色的团块物质，里面充斥着小颗粒。
我是很想凑乎下去，就这么个实验条件，我已经尽力而为了，老板急着要文章，我也急着要滚蛋。但如果就用这种细胞做下去，即便我不想造假，实际上就是在造假。支原体污染后，信号通路混乱，得出的结果就是似是而非的东东。
临渊羡鱼，还是退而结网，这是个问题，斟酌再三后，我决定用plasmocin处理。当然细胞重新购买是上上策，但是中科院上海库还是协和库里的细胞，买来就是买一送一，没给你送真菌就是万幸喽！ATCC的细胞株国内引进是七千元一株，我需要8株细胞，老板要么自杀，要么杀了我，这是天堂鸟，我够不着。plasmocin很贵，50毫克打折下来是1500元人民币，能配两升完全培养基。连续处理2周，每隔两天换液，我用的是T75的瓶子，每次25毫升，成本算下来比抗体还贵，因为抗体至少可以回收重复使用。
处理后，我的感觉是日日惊心。具体表现是：1.原本清澈的培养基里漂浮出一些黑色的团块，随污染程度不等而大小多少不等。2.细胞形态发生了惊人的变化，原本细长梭性的细胞变成了上皮样，原本结片聚团的细胞开始分散成单克隆样。我发现处理后细胞形态逐渐能与ATCC和文献上的图片一致了。很可惜，我们实验室没有显微照相设备，我只能用文字来描述了。
处理两周后，我有做了转染，puromycin在4ug每毫升的浓度下筛选出了稳转株，实验终于可以继续下去了！
许多时候，我都在想有多少爱可以重来，国内库里的细胞大多都是支原体污染，大家都在做着似是而非的东西，老板们梦想着骑着自行车登月，良心与良知，泯灭在这些乌烟瘴气里。现而今我甚少佩服海归或老外，就我这条件，你TMD的做实验试试。

作者: yxc 时间: 2011-11-10 06:48

谢谢楼主详细的描述与经验之谈！) `" }) z! T; T- z. D
我们能做的，其实最主要的还是要无菌，养好细胞的关键就是无菌意识，这是细胞实验的关键、基础。灭菌这一关可含糊不得。

作者: 流泪的鱼 时间: 2011-11-10 07:24

我认为：第一，支原体是使细胞生长速度变得缓慢甚至死亡，但是支原体不结成团块。
            第二，你确定你细胞所污染的是支原体吗？细菌、霉菌？) L  |) i' H( T9 @
            第三，有些特殊培养基是抗支原体的。国内国产的药物也可以抗支原体，不贵。

作者: a86856635 时间: 2011-11-10 08:34

张经验了

作者: 鹭岛之滨 时间: 2011-11-10 09:13

额，没看明白怎么回事。我们实验室每次污染，是什么污染一点定论都没有，唉，是该好好学习

作者: panyanfei 时间: 2011-11-10 09:31

支原体？用什么方法检测确定了吗？

作者: lele 时间: 2011-11-10 11:16

谢谢楼主跟我们分享经验。
做实验最关键的还是要有严谨的科学态度和不懈的精神。

作者: 懵懂干细胞 时间: 2011-11-11 08:11

我悲剧了！昨天检测了一下我的三种细胞，结果最重要的一种有支原体污染！1 c" w: M) F! G
悲剧了！做出来可要个把月的时间啊！

作者: 翅膀111 时间: 2011-11-11 08:31

我有一段时间也遇到这样的问题，细胞生长缓慢，培养基偏紫色，瓶底有一些沙子样的沉积，细胞逐渐死亡，没怎么检查，停了一段时间，把细胞室内仔细处理，培养箱严格消毒后才好点。实验室人多的时候尤其要注意控制环境啊，一不小心就前功尽弃了。

作者: have-a-rest 时间: 2011-11-11 08:46

要去除环境污染，似乎要甲醛熏蒸，细胞的话，污染的最好丢弃。不得已可以用plasmin处理。

作者: hany2007 时间: 2011-11-11 18:26

支原体污染也有可能造成细胞增殖速度加快的，环境再注意，但如果买来的细胞本身就是买一送一的支原体，那还是得用plasmocin处理。尽力而为吧，这是个良心活

作者: 牙牙丫丫123 时间: 2011-11-12 16:49

你的这个情况我也遇见了……就在今年7月份，把该扔的扔了，把库里的细胞全部复苏检测了一遍……一直折腾到10月，期间发现做实验结果也是很闹心……不表达的基因全表达了……

作者: sijicc 时间: 2011-11-13 15:19

1 细胞结团并不是支原体污染的表现2 F! F1 u6 {. A. K
2 建议你购买支原体检测试剂盒进行pcr检测9 w/ \1 c( t) U0 ]3 A$ z- c
3 不要被所谓的支原体去除试剂欺骗，我使用过2种进口的支原体去除试剂，效果并不明显。一旦确定支原体污染，立刻抛弃。

作者: huangcong1988 时间: 2011-11-13 21:24

回复 hany2007 的帖子 v/ Z5 v8 v" x" [* R3 _

其实细胞密度稀了之后细胞不容易生长也可能是有黑胶虫，因为虫子跟细胞也是竞争生长的，一旦细胞密度降低了，虫子就会趁机长得很多，消耗营养，所以细胞会长势不好& k) T7 Q& `! L
现在去国内细胞库买细胞确实是存在这么些问题，他们给的很多时候都不是状态那么好的细胞，所以回来以后，细胞长势会很受影响，而且一般买的也不便宜，所以，如果有条件的话，建议自己分，自己分的细胞质量要好很多，而且如果是一般动物，买动物原料也很便宜7 d$ x0 U _" h! n
实验操作也要注意哦，实验条件有限的话一定要注意操作

作者: 懵懂干细胞 时间: 2011-11-13 22:49

这些天我就是在复苏细胞并一一做支原体检测，但是发现了一个问题，就是同一个孔里面的细胞不同时间检测出来的结果不同？同一个孔里面的细胞，间隔时间也就一天怎么会不一样（第一天检测有，检测的时候把所有的培养液换了，第二天检测就没有了）呢？不明白为什么，不可能是我编号错了，也不可能是PCR仪的问题（阳性对照很亮）。难道是试剂盒的问题？难道是支原体还没长出来？

作者: hany2007 时间: 2011-11-14 01:26

可能有潜伏和活化的原因吧

作者: bobo198666 时间: 2011-11-14 15:41

养细胞过程中早晚都要进细胞室观察细胞状态，不能偷懒，如果发现污染及时扔掉及时处理，是能挽救的了的，如果把细胞放在培养箱里好几天不管，污染可能性很大，还可能影响到别人

作者: yyshpy 时间: 2011-11-14 17:54

很好的经验，受用了

作者: llecstem 时间: 2011-11-25 11:08

回复懵懂干细胞的帖子

想问一下，支原体导致不同细胞间交叉污染几率大不大？和我同一个细胞培养的细胞，我的ES没有支原体污染，但是其他的细胞有的污染了支原体。现在挺担心自己的细胞的，现在依然和不确定是否支原体污染的细胞共用一个培养箱。

作者: webber43 时间: 2011-11-25 11:17

回复 hany2007 的帖子
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谢谢楼主分享，顺便问一下楼主是哪个城市的呢？

作者: leisong12 时间: 2011-11-26 22:26

呵呵，快点出站吧，管它呢。

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