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标题: 瞬转后用puro/nero杀哪个好点 [打印本页]

作者: hyde 时间: 2011-11-13 09:38 标题: 瞬转后用puro/nero杀哪个好点

电转后细胞用puro杀总是养不活^^
考虑过用nero,但时间太长质粒还能起作用吗?

作者: 懵懂干细胞 时间: 2011-11-13 10:08

puromycin ? 你用多大的浓度啊？细胞数目怎么样？细胞少的话用药浓度就低一点，这个条件自己慢慢摸一下！

作者: xiangchou812 时间: 2011-11-13 10:30

我最近刚做了一下puro的筛选梯度，在山羊成纤维上做的，感觉浓度在0.2－0.4vg/ml之间。

作者: shylook 时间: 2011-11-13 12:12

puro 不过得做下梯度摸好浓度7 L, x; i- p" o: j9 e
nero不行细胞很容易产生抗性

作者: jj.jianjia 时间: 2011-11-13 12:31

我用lipofectamine转染fibroblast，用2ug/ml 的puromycin，每次都几乎没有活口。难道是浓度太高了？

作者: hyde 时间: 2011-11-13 20:44

我用5u/ml 的puro杀感觉都有活口的，但细胞长的像薄饼，扩不出来的……（电转的），细胞原来是100万/ml
有些paper用的nero，杀十几天的……% i, J0 N2 w# c$ C" @* U' Y% ]# @
求有成功经验者给予指教……

作者: zzc2211 时间: 2011-11-14 01:10

我是做肿瘤，不同细胞对puro的耐受不同，从25ng-500ng/ml都有，首先摸一下耐药浓度，48孔板，倍比稀释，可选加药后7天左右全部死亡的浓度做筛选，同样也是筛选7天左右。也有偷懒的办法，1ug/ml，3-4天或2ug/ml，2天。但个人经验后者不如前者，一筛全死的情况常有，而同样的细胞用第一种方法能够筛出来。理论上讲不过去，但我研究的蛋白就是如此。可能受转染效率，目的蛋白功能，细胞密度等等的影响吧。建议楼主还是摸浓度后再做。有时候偷懒的办法更费事。

作者: zzc2211 时间: 2011-11-14 01:14

另外转染后，细胞传10代，质粒一般没问题。超过此时间就难讲了。如果研究knockdown，理论上用高浓度，短时间的迅速筛选好一些吧。往往理论和实际操作有出入。

作者: jj.jianjia 时间: 2011-11-14 01:39

回复 zzc2211 的帖子" y8 }# R; e- K3 y E$ Z
9 p6 n3 O- f) d, ~: |" M U: Y8 U% |
我买的puromycin说明书上让尝试1ug-10ug/ml的浓度，3-5天筛选期。
再问个问题：过完筛选期之后是不是就立刻去掉puromycin？多几天时间细胞也是会死的？

作者: hormone008 时间: 2011-11-14 09:40

最好用嘌呤霉素puromycin，效果好于G418，G418要很久细胞才开始大量死亡，假阳性也很多。相反，puromycin就在这两点上好于NEO$ C: j1 X+ a- ^9 Y# F& N: R
抗性！3 `2 V5 \0 O+ F3 c

作者: linzi214 时间: 2011-11-14 09:42

嘌呤霉素是抑制细胞有丝分裂的，应该是接种细胞的时候就加进去

作者: hyde 时间: 2011-11-14 12:44

药杀是每天都要换液吗？
电转后几天开始杀比较好……试过2、3天的，有时候感觉药杀后细胞的荧光增强了……是不是质粒整合进去了（用线性化质粒）

作者: hyde 时间: 2011-11-14 12:46

感觉（不加质粒）电转的细胞和不电转的细胞进行药杀效果不太一样…………摸药浓度是不是应该用前者

作者: bobo198666 时间: 2011-11-14 15:09

puro好于G418，在筛细胞之前要测个puro浓度梯度，三天内逐渐把细胞杀死为最佳浓度，一班是0.7ug/ml，筛细胞后两天加药两天正常培养基，前后一周的时间久出克隆了

作者: zzc2211 时间: 2011-11-14 21:13

回复 jj.jianjia 的帖子
( E2 h# g7 T" U8 E# s
筛选之后最好低剂量维持筛选，维持浓度可以倍比稀释摸一下，puro一般维持浓度在50-200ng/ml，细胞不会死。我们做慢病毒感染，不利于细胞原来体系的目的片段有可能被去除。即使低剂量维持，往往knockdown后传代10次，也不能确保功能维持。我们最终目的是研究功能，慢病毒感染后，多冻几支，每只能用3-4周，时间久了，和刚感染后的时间点相比功能有改变，就丢掉。因研究的目的蛋白不同，做法可不一样。根据蛋白在细胞的功能重要性，有些蛋白不维持也可。

作者: bobo198666 时间: 2011-11-14 22:22

puro比G418好，G418假阳性很多，如果是puro筛需要加两天药，撤两天药，G418可以一直加药

作者: jj.jianjia 时间: 2011-11-16 07:49

综合各位的回复，总结如下：0 y! E" P. T* |
1. 转化前先摸索浓度：加药后7天全部死亡为标准，或者1ug/ml，3-4天或2ug/ml，2天；前者可能细胞存活率高于后者，+ F; }3 G6 _% C2 d) b' b* u. v- U
不同细胞耐受性不一样，xiangchou812：山羊成纤维-0.2－0.4ug/ml;- q( {% }2 F; m4 T' g+ V
                                       zzc2211：肿瘤细胞-0.025-0.5ug/ml;
                                       bobo198666: 0.7ug/ml ;" g4 `+ Z. F# O8 ?6 ]4 h* o+ O
2. 转化后两天之后加入puro筛选，加两天药，停两天，一周左右出克隆；  B$ H- o, Y8 h; \
3. 筛选之后最好低剂量维持筛选，维持浓度可以倍比稀释摸一下，puro一般维持浓度在50-200ng/ml，
4. 10代之后，效果变差。

作者: jj.jianjia 时间: 2011-11-16 07:51

不过还有个问题：我做浓度梯度摸索的时候，到第五天，puro浓度为1ug/ml的孔中，细胞死了大部分但是还有大约1%的贴壁，这种情况下，算是死了吗？2.5ug/ml的孔就基本上一个不剩了。所以我选用了2.5ug/ml的浓度。这个浓度还是太高了？

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