干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
质粒浓缩 自己的小尝试
[打印本页]
作者:
huangcong1988
时间:
2011-11-18 16:29
标题:
质粒浓缩 自己的小尝试
我想把提出的质粒，直接加上酒精，然后混匀，过柱，完了之后直接加水（一半体积的水），这样能使质粒浓缩么？
8 W6 f$ d& i) q- B
" a1 ^; m" I+ M ^4 |% U: U; y
补充内容 (2011-11-18 16:30):
6 E. a, h0 L. d2 a, X
酒精体积为质粒体积的三倍
作者:
寂静兔
时间:
2011-11-18 19:11
+两倍体积无水乙醇，和1/10体积5M NaCl，离心即可沉淀
0 t2 I+ e" T0 W$ p
用水溶解就行
作者:
星移龙一
时间:
2011-11-18 19:37
我这有一套浓缩的步骤，而且可以消除蛋白。
; r/ L0 P+ K- P( A4 N
1 |/ w5 C z6 w* v8 R
无菌处理（对DNA进行浓缩和无菌处理，可直接用于后期细胞的转染实验）
( w1 Z* t( e7 C
通常最后溶解用500ul灭菌超纯水（不足时用水补足）1V，转移至EP管
y2 ?6 ?: d+ A$ I* z* Q& [$ F
↓
! ?! K d% u2 U6 w; m
加1/10V 3M NaAc（50ul）+2V无水乙醇（1ml）
) t& ]; |( O$ _# D! b
↓
7 J( Y+ C1 K) {: [3 _. _
-80℃,15~20min
" }4 p1 ]6 r$ D+ g5 o& J* m0 Z. K9 w
↓
. |1 S* x7 u0 _) l
≧13000rpm,15min
; ]4 f/ `; E }) N
↓
# M6 u4 f& X0 s* Y6 N# m
小心吸弃上清，加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀及整个管子内壁（可以把沉淀弹起） ；然后13000×g 离心1min 收集质粒沉淀。吸弃上清，注意不要把沉淀吸走；
8 O9 U% r2 D' s2 a: Y( M2 p# K# A
↓
# P2 d0 X5 u- y2 Y H
（可重复洗涤一次）
$ A' a5 A, ?. ?9 U7 R8 O- F, q8 @
↓
0 @4 o# [/ R4 ^$ E. C9 l1 z
把离心管置于离心机稍为甩一下（离心几秒） ，把管壁的残留乙醇离下，然后用小枪吸走管底的乙醇液体。
( y3 Z0 a" Z3 q7 |$ S- M" j
↓
& v# X- C9 H% q* ^) i4 t
开盖干燥，让其风干，直至看到一层薄膜状（透明） (10~15min)
3 ~/ T b I I2 _6 w/ U
↓
/ q3 b) R J* }: R/ I% E; M/ Z
即可加入（40~60ul）超纯水溶解，由开始的沉淀团块大小决定。
+ [' `& n* ]5 d$ l* E- h
（取2ul至78ulddH2O测其浓度及OD）
, w0 B7 X. ]5 m* h) o; j3 \
作者:
开心果王
时间:
2011-11-18 22:35
楼主有没有用过omiga大题的盒子，里面有浓缩的步骤啊！可以搜索一下，直接用酒精会不会损失太大啊，好像中间要用到NaHAc的！
作者:
sizhengliu
时间:
2011-11-19 11:30
QIAGEN的说明书关于浓缩的步骤是这样的：（15mlQF洗脱后）
# |' ~+ p9 f" v/ N( N
1，10.5ml异丙醇加入，4度离心15000g，30分钟，
3 Y' s# u) t2 D5 S5 S9 U$ [& j
2，弃上清，加入5ml 70%乙醇重悬沉淀，离心15000g，10分钟
5 S1 e+ h- [( m+ Q9 r0 y
3，弃上清，风干
1 o( Q- q0 b o$ J" B, J+ Q
这时，你可以根据你想要的浓度，加入适量TE或纯水溶解沉淀。
作者:
梓玥
时间:
2011-11-20 16:50
用真空浓缩机也行的。
作者:
张也行
时间:
2011-11-22 04:20
这个要看你原来的质粒浓度多大了，如果是大提的，浓度很高，那么上面浓缩的方法都可以，如果你的质粒浓度很低，那么用上面的方法浓缩（除了用真空浓缩机），最后估计什么都没有了。因为任何一种浓缩方法都会出现损失，一般情况下起始浓度越大，损失率越低。
作者:
huangcong1988
时间:
2011-11-22 08:57
回复
张也行
的帖子
1 C3 G z3 a) T* I
# z. o( ?# Z8 X1 z$ r4 a" j
大提浓度高？应该是不高吧？经验告诉我们，大提量比较大，但是一般浓度不高吧？起始浓度越大，损失率越低，这个是为什么呢？
作者:
张也行
时间:
2011-11-23 02:28
回复
huangcong1988
的帖子
3 s* _9 t6 s! Y% x9 n
$ R" {& \, U5 e- t: C f% `
你们实验室小提浓度比大提高？！估计和你们用的试剂盒有关吧，我们这边都是大提浓度高~
4 [, `; C! q; N' Y) O `/ Z. v
6 B4 R8 z; |3 d* e# W: {
至于起始浓度大，损失率低这个也是我的个人经验。你可以试试。
作者:
huangcong1988
时间:
2011-11-23 08:51
回复
张也行
的帖子
/ B' e# y0 f4 P
. V$ U K/ I! o) i0 X5 Z: f
恩，我们用omega的，一般情况下是小提质粒浓度比大提要高，但是小提的量是没法跟大提比的
欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)
Powered by Discuz! X1.5