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标题: 求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？ [打印本页]

作者: stefan 时间: 2011-11-21 21:28 标题: 求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？

求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？
  1、近段时间准备对犬骨髓干细胞表型CD90/CD45作流式鉴定，但是无法买到抗犬的细胞表型抗体，想用人的抗体代替，不知道能不能行？有哪位大侠做过的指教指教？？
  2、还有就是想请教有人用过eBioscience公司的流式细胞产品吗，不知道效果怎么样？
  3、小弟刚开始做流式，这方面比较不熟悉，了解的朋友能否给个流式细胞细胞表型鉴定具体的实验步骤啊？越具体越好，这里先行谢过了！

作者: wangzhiqi86 时间: 2011-11-21 22:39

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1 r( i4 D( H! `0 m6 O: k
抗犬的估计很难买，因为大多数都是抗人和抗鼠的，我当时买抗兔的也很难买到，建议你几个公司吧，millipore、AbD Serotec、Antigenix America、BD，这几个都不错，特别是Antigenix America的很多抗体都是别的公司没有的。 S# c7 e9 I8 d& F0 u! V$ o
这是我做的具体步骤，你参考一下
①P5×105 cells—1×106 cells/样
②抗体稀释液洗涤, ^0 ^9 K& N [: _1 O
③加入一抗，4℃避光孵育30min
④抗体稀释液洗涤
⑤加入二抗，常温避光孵育' c3 r0 @6 ~6 O0 b+ }6 @$ b" N$ g
⑥抗体稀释液洗涤
⑦加入抗体保存液，4℃避光保存待测
注：如果一抗自身带有抗体，那就不需要⑤、⑥步。

作者: wangzhiqi86 时间: 2011-11-21 22:40

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买抗人和抗鼠的，与犬有杂交的也行，但是交叉结合效率就不好说了

作者: gact 时间: 2011-11-22 09:34

看看基因序列，，，，

作者: 卡门 时间: 2011-11-24 12:34

eBioscience公司的流式产品我们实验室也有很多人用，比起BD的要稍微差一点，但你需要检测的指标比较一般，没有特殊的要求或表达量很低，所以用他们公司的足够了。
一般买的流式抗体都是一抗上带了荧光的，所以可以直接染，而且你要检测指标都是膜上的，步骤比较简单：
我们的染色步骤，供参考：
1x10*6---10*7的细胞用PBS洗涤，1500rpm  5min
   去除上清，用PBS100-200ul重悬% E+ P+ j3 H- e# W: ^  _: ?3 \
加入流式抗体，根据说明书每个test的用量，其实可以稍微少加，有人用一半的量也能做出，但该开始的时候，还是按说明书来加
4度避光孵育15-20min，加入1ML的PBS重悬、混匀
1500rpm 5min离心，去除上清，重复2-3遍  v% `. W: R% t& R6 a- I% |
最后去上清后用300ulPBS重悬，混匀后即可上机检测
PS:染色过程中，注意尽量避光，及4度孵育的环境

作者: ylj 时间: 2011-11-24 15:48

这抗体是很少用，不过想提醒LZ，间充质鉴定光用以上两抗体是不成立的！
流式表面抗体发育我们一般是：
1、收集细胞，分装；
2、PBS洗两次，200G离心5min;
3、50ul PBS重悬，加入相应抗体混匀，4°避光孵育半小时（10min混匀一次）；$ N% l! I* F% O- h
4、取出加入1ml PBS洗两次；
5、200ul PBS重悬后直接上机或1%多级甲醛固定后4°保存待检。

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