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标题: 关于组织切片中GFP的检测 [打印本页]

作者: phdyhm 时间: 2011-11-26 12:13 标题: 关于组织切片中GFP的检测

含有GFP标记的组织冰冻切片后，在荧光镜下可以看见有明显的发绿光荧光的细胞，通过福尔马林固定，再做免疫荧光，绿色荧光细胞就基本找不到了，请高手分析下原因，下一步应该怎么做？

作者: jhu132llh 时间: 2011-11-26 15:44

福尔马林主要成分是甲醛8 B, o5 l' F) X
规定那个是会发生蛋白交联从而荧光淬灭
试试抗原修复也许有效

作者: jhu132llh 时间: 2011-11-26 15:45

福尔马林主要成分是甲醛3 _$ }; l' H7 @
规定那个是会发生蛋白交联从而荧光淬灭
试试抗原修复也许有效

作者: langziforever 时间: 2011-11-26 22:51

嗯，同意楼上所说！福尔马林固定后应该是看不到GFP的自发荧光了的！你可以用免疫组化比如anti-GFP来看GFP的分布吧！

作者: phdyhm 时间: 2011-11-26 23:01

福尔马林固定只是一个处理步骤，最后肯定是要使用抗体的。我说的是加了anti-GFP以后出现的情况。

作者: qwmwolf 时间: 2011-11-27 10:19

1、蛋白可能降解。理论上蛋白在取材两小时后就有不同程度的降解了。
2、其他的某些物质在操作过程中如果渗入组织中也可能产生干扰。先前有检测皮肤组织中绿色荧光，发现苦味酸也能在检测到绿色荧光。

作者: qwmwolf 时间: 2011-11-27 10:23

下一步，你可以直接用免疫荧光检测GFP在组织中的表达，做好阳性对照，也有可能是抗体的原因，现在抗体出问题的几率也不小。

作者: ilovelife 时间: 2011-11-29 03:50

楼主的意思是想测内源性的GFP表达（分子克隆手段引入的GFP），不同于抗体铰链的GFP检测吧。楼主可以不用福尔马林处理，直接用DAPI染细胞，然后在荧光显微镜下和光镜下分别拍照即可。

作者: yinjiqingqq 时间: 2011-11-29 09:36

回复 phdyhm 的帖子

我以前做冰冻切片检测荧光时，也出现类似情况，不过我是用丙酮固定的，你可以换成乙醇试一下。如果不行，就做石蜡切片吧，用抗原修复后，效果还不错。

作者: dianying 时间: 2011-11-29 09:57

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Try 10x Citrate Buffer pH 6.0

作者: goodboy 时间: 2011-11-29 10:11

GFP蛋白荧光是要在其非变性时才能显现出来的，经过甲醛变形之后肯定不会有荧光。所以你应该做石蜡切片

作者: zxcv12345 时间: 2011-12-5 19:07

回复 phdyhm 的帖子: L5 O: {$ r& R
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我用甲醛固定细胞系，GFP没有问题。没做过冰冻切片。你可能的原因是可能固定时间过长。减少固定时间看看，做个时间梯度，看看在那个时间段GFP信号丢失。
荧光镜下可看到银光，应不是蛋白降解
乙醇、丙酮不能固定GFP表达蛋白。

作者: namulow 时间: 2011-12-6 00:18

请问：骨组织切片的话，如何才能更好的检测GFP? 冰冻切片还是石蜡切片？是不是比软组织切片更难一些？

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