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标题: 临床干细胞分离方法讨论 [打印本页]

作者: monday2019 时间: 2011-11-28 14:00 标题: 临床干细胞分离方法讨论

这些天在做干细胞分离方法的一些汇总研究，看了很多相关的报道和文章，不过整个思路都还比较混乱，还是和大家分享分享吧，也希望一些专业同仁能给些意见。. C+ l% j( F( Q
流式细胞技术分选法（FCM)，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。主要仪器是美国BD公司的BD FACS Aria流式细胞分选仪。
免疫磁珠法（MACS)，核心是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应，在细胞表面形成玫瑰花结，这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会与其他未被结合的细胞分群。
密度梯度离心法，用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
负收集法，将不需要的细胞作为靶细胞用Lin抗体络合收集到一起，保留Lin阴性细胞，再用密度梯度离心法去除残留红细胞等，获得干细胞。

不过还有几点疑问：
1，如果只要用到离心机的，都应该算是离心法，包括密度梯度离心法。Ficoll、peroll、甲基纤维素、明胶、淀粉等分离液法，是不是也应该属于离心法？羟乙基淀粉沉降法，如果用离心机离心（我看有的试验用离心有的没用），那是不是也是属于离心法？这么说来，负收集法也是一种离心法？; G* w: ?9 {9 j
如果这样的话，分类应该变成FCM、MACS和离心法，离心法下分分离液法、沉降法、负收集法。
2，国内开始引进自动化系统分离干细胞，AXP和Sepax，经常和人工的技术作比较，这两种自动化系统，都是离心法么，都用什么试剂么？+ ^: M9 b! ]5 y' E, S; {/ `' J. k
3，目前临床是用的较多的，有没有人知道都是用什么方法？' i# x X- Y5 d; T3 G: R
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肯定有很多说的不对的地方，大家见笑了，多多指导！

作者: yxc 时间: 2011-11-28 18:39

1.主要依靠离心机的方法，才应该算是离心法
主要包括密度梯度离心法，包括Ficoll、peroll等分离液。
沉降法、负收集法是区别于密度梯度离心的特殊离心法，有各自的原理支持。
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2.AXP Auto Xpress™ Platform系统是用来收集脐带血中的富含干细胞的部分，主要是为降低细胞采集期间受污染的几率提供一个密封及无菌的环境，与传统人工采集的原理并无本质区别，官网http://www.gelifesciences.com/ap ... t/LD_338528314-J450( I% L  L+ B# d7 @& B
有pdf全文6 F& G% ~- L; m" c

3.对于多数刚开展干细胞研究的单位来说，密度梯度离心法是比较适合的，设备、试剂的获取、价位、可操作性比较理想，但对于计划今后大规模应用的单位，肯定有大厂家瞄准商机制造出更好的设备，期待权威分析。1 t7 b- O" q  M  L

作者: yxc 时间: 2011-11-28 18:43

ThermoGenesis AXP AutoXpress Pl[attach]36107[/attach]atform

作者: wangyashuai 时间: 2011-11-28 19:08

我以前看过可以用多次传代的方法纯化干细胞，这是不是因为干细胞可以传代生长，而普通细胞不能传太多代，就死光了。

作者: ljcc 时间: 2011-11-29 07:59

是否也多次放疗后残留的不敏感细胞也可代表干细胞，另外无血清培养基培养出来的细胞球也算干细胞。

作者: dwl1209 时间: 2011-11-29 09:12

只要是涉及到离心的，你都可以认为是离心法，只是根据实验室的各种情况所选试剂不同，用途不同而已。离心法成本最低，而其他的FCM和MACS等成本相对较高，但其纯度较高，也就是各有优缺点，这个要看实验室的具体情况了。至于你说的分法，我倒觉得为什么非要分个类呢？很多时候很多干细胞的分离貌似都是不只用一种方法，而是结合起来使用的，比如Ficoll分离和FCM的结合使用。临床级别的干细胞，能减少中间环节的尽量减少，但这往往跟干细胞类型分离效率又有关系，说这个可就有点复杂了。理想状态下的分离肯定是既要不受外界影响还要保证临床效果，这个探索可就遥远了。个人意见，仅供讨论。

作者: monday2019 时间: 2011-11-29 11:30

其实并不是非要分个类，只是希望能够从分类的角度对干细胞的分离方法做个汇总，供大家参考讨论，也可以看看目前临床上多采用什么样的方法。多多交流！

作者: 晏子 时间: 2011-11-29 11:56

首先用HES沉淀，然后Ficoll密度梯度离心，若混有大量的红细胞再加细胞裂解液！

作者: 松鼠 时间: 2011-11-29 21:34

看过一篇文献《自体骨髓间充质干细胞移植治疗肝衰竭》中，骨髓间充质干细胞的采集和分离方法如下：
移植组患者在接受1周的药物治疗后，在严格无菌的条件下，以髂前上棘为穿刺点，抽取骨髓100-120ml；在无菌的细胞培养室中利用密度梯度离心法进行分离，用生理盐水稀释骨髓后，缓慢加入等量的percol分离培养基，在离心机中以2500转/分的转速离心30分钟。分离得到单个核细胞，并用10ml生理盐水冲洗3次。收集细胞悬液并保存在10ml生理盐水中，其中0.2ml接种在含有10%胎牛血清的L-DMEM培养基中。

作者: dinghuqing 时间: 2011-11-29 23:01

这个讨论很好诶。可以跟大家学些东西哦。关注这些研究，期待干细胞研究的成果能尽快的更多的用于临床！！！

作者: monday2019 时间: 2011-11-30 14:49

回复 yxc 的帖子
5 i9 N( r3 |0 @6 N" z, Z% o
很专业！多谢！) b1 N' k8 ?" S$ u# y! [
仔细看了下负收集法和AXP自动系统，负收集法去除了LIN阳性的细胞，即大部分不需要的成熟有核细胞，再和密度梯度离心法结合去除红细胞、血浆等，得到所有的干细胞；我看AXP系统介绍里面提到它分离出来的是一个BUFFY COAT，BUFFY COAT里面有白细胞、干细胞和部分RBC及血浆，那也就是说，是不是负收集法去除的非干细胞量较AXP更多，纯度更高呢？
我看国内用AXP系统的干细胞库越来越多了，不知道AXP系统能不能用来分离骨髓和外周血呢？如果可以的话，那未来临床上岂不是也有可能用的更多，医院可以把成本转嫁给病人的嘛~- c+ I! Z$ \" W# @9 Q' c

作者: yxc 时间: 2011-11-30 15:24

关于负收集法和AXP自动系统两种方法所获取的干细胞的纯度，尚未见有人做出直接比较。/ B* f7 M/ q$ s9 S
AXP系统在国内主要应用于干细胞库建设，随着医院干细胞研究及临床应用的发展，将可能应用于外周血干细胞的采集，骨髓量小，一般不用吧。* O" [1 {) P2 b# U- [2 z
关于费用，希望是于成本呈正比的同时，尽量也与效果正相关。3 M% o3 w8 S# c: T! O( b
望指正。

作者: monday2019 时间: 2011-11-30 15:34

回复 yxc 的帖子- P, d& U0 q* F% w5 u; D& G

感觉现在很多医院都建了干细胞临床治疗中心，效果和合法性先不说，数量倒是也不少了，特别是军队医院，这些临床的医院应该多是骨髓和外周血吧？
刚翻看thermogenisis的产品线，有个产品叫MXP的，貌似是骨髓用的，国内有用么?您听过么？

作者: yxc 时间: 2011-11-30 19:43

回复 monday2019 的帖子/ `2 a4 h$ e1 X/ I; n
( r& ^8 U: d( @4 L! q" J
国内医院开展的干细胞治疗不仅有骨髓和外周血，还有脐带干细胞。
  你说的是MXP就是MarrowXpress™吧？没听说过国内的应用情况，估计还是受到骨髓的本身影响。
6 y9 q4 H& r2 m
这是其介绍/ ^& U( a% Y: N) G' |! F9 w
Advanced bone marrow processing, stem cell harvesting, and data tracking., E4 Z) {& l3 u- G; H
The innovative MarrowXpress™ (MXP) System defines a new processing standard for isolating and retrieving stem cells from bone marrow aspirate. It’s an automated, fully closed, sterile system that volume-reduces bone marrow to a user-defined volume in 30 minutes, while retaining over 90% mononuclear cells (MNCs)**. Self-powered and microprocessor-controlled, the MarrowXpress platform contains flow control optical sensors which achieve precise separation." Q) r1 r+ N: [6 E; w! ?- G

Automated, closed system
Precise cell separation" a% i, W/ g0 h- t! ]
Low residual red blood cell contamination
Sterile in-line sampling$ K1 M, Q' j8 p- Q& Q8 X, r
Rapid sample processing% e, F4 I& W3 W% B- l' g

Hands-free operation — Automated, closed, sterile system.
2 x. ]7 R/ I' M: @) M$ F" n
High yields — Consistently high MNC recoveries and CD34+ recoveries.*

Reliable volume reduction — Reproducible reduction of initial unit volume to a user-determined final volume.) ?8 M0 }, I( c$ m& T: M$ \. C! a' B
+ i' T" K/ M8 J, I+ O/ S8 f1 y+ Z8 o
Streamlines workflow — Simultaneous processing of up to six samples.

Safe operation —  In-line sterile sampling.  }% p" g. W8 W: G' o$ v
# r, M9 w5 Z& D9 O+ p
Easy data management — Quick and accurate data tracking with XpressTRAK™ software.
6 ?3 X1 {8 ]; h5 ^9 {1 V
Rapid sample processing —  Sample separation and concentration complete in 30 minutes.
) z/ D0 S! Z% ~1 f. V
Self-powered —  Powered by a rechargeable NiMH battery.) ]# u3 _  {' O' c7 `( z. {& a

Real-time Communication — XpressLINK software provides the ability to link data from all AXP devices.6 T! _) Z6 l/ J* |6 y) R
Complete system solution — The MarrowXpress™ System consists of the docking station, processing set, and XpressTRAK™ software that assists with cGMP and cGTP compliance.& }: c) X6 Q  K8 P, _

作者: monday2019 时间: 2011-12-1 10:20

回复 yxc 的帖子
& Q1 w: M7 c' R, @5 q0 Y
干细胞临床治疗，如果用脐带干细胞的话，大多是到脐带库里面去配型，多用于血液病吧？: z* r; R+ j4 ^6 z' v# s
国内除了血液病，其它的临床资料就只能用骨髓和外周血了吧，其中外周血应该更多一些吧？这些医院或者临床治疗中心现在大部分都用人工的吧，未来我觉得也有引进MXP的可能吧，或者THERMOGENISIS再推出个PXP之类的，用来自动分离外周血。

作者: monday2019 时间: 2011-12-1 10:59

回复 yxc 的帖子

其实关于负收集法和AXP系统的纯度的问题，我只是不太明白，负收集法第一步去除LIN阳性的细胞，第二步去除红细胞等，剩下所有种类的干细胞，而AXP系统或者是传统的手工分离系统，我感觉只能出去负收集法里面提到的红细胞，不太明白Lin阳性的有核细胞是在哪里除去。现在负收集法用的多么，我怎么感觉这个方法较传统手工方法更优似的~
问题比较基础，专业人士给外行科普科普呵~

作者: yxc 时间: 2011-12-1 12:33

干细胞实验及临床研究所包括的病种很广泛，包括用脐带干细胞，远远不只血液病。

作者: kenken 时间: 2011-12-6 16:22

国内有很多医院的临床科室如消化，骨科，风湿科，内分泌，神经内外科，皮肤科，感染科，美容都在用，很多都用的是脐带血，所谓的负收集法。

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