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标题: 荧光燃料选择 [打印本页]
作者: 飞翔的十字架    时间: 2011-12-1 20:29     标题: 荧光燃料选择

实验需要要对细胞进行多染，初步计划是染蓝色的核，还有FITC 和 TRITC ，但还是需要一种颜色， 请大家给点意见，没有头绪阿
作者: susannajoke    时间: 2011-12-1 21:53

本帖最后由 susannajoke 于 2011-12-1 22:00 编辑
9 `2 D# T, v2 Y# ~. z/ |
4 R! E% ]5 L4 i- l( [$ ?以下是常用的免疫荧光的二抗荧光基团，前面的可由后面的Alexa Fluor或DyLight 荧光标记物所替代：
6 _8 _* b9 h1 O0 j' A+ eAMCA, coumarin——Alexa Fluor 350；0 s# j6 F; u* A, y
Cascade Blue——Alexa Fluor 405、DyLight 405 ；
' K+ N& t  K* |' [; GCy2, FITC (fluorescein)——Alexa Fluor 488、DyLight 488；
0 l' [- y& b- ?3 CCy3, TRITC (tetramethylrhodamine) ——Alexa Fluor 555、DyLight 549；
+ |# J$ i- v0 ]6 ?& nRhodamine Red——Alexa Fluor 568；
' X7 ^+ V4 T8 C- g5 e) V) e1 BTexas Red——Alexa Fluor 594、DyLight 594；
  s6 s' w1 J; S& l  g$ F7 cCy5——Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, or Alexa Fluor 647、DyLight 649；
" K8 O$ f* e8 P* C4 R* @Cy5.5——Alexa Fluor 680；/ j- U; o3 F! N* ?; F- Z( E
Cy7——Alexa Fluor 750。
6 Z, e" S, h# N下图为染料激发光谱和发射光谱，希望你结合你们的荧光显微镜光源来选择合适抗体，加粗的染料是我推荐的。
% I: }- t0 u# c; c* o# g5 Y& w; Q
# B" z' |+ {/ U" h# y, o+ S 无标题.jpg 2.jpg
0 V; H; P9 b* d' |; }) C( E' F7 T! N! s
附两张图片
) p2 R6 E& B* h4 F. G) z" D 无标题.jpg 2.jpg
, q: }( k4 [% d$ T: v7 c/ c/ S$ K1 x! i# k/ ~1 e; K3 l" a7 B* o
其中，Alexa Fluor为Molecular Probes(Invitrogen)公司产品，DyLight 为Jackson公司产品。
. W5 T6 s. w5 V8 v3 O( qAlexa Fluor 350——亮蓝和紫外光激发；1 C- \0 ^8 s9 f6 R' r
Alexa Fluor 405——近乎完美的匹配蓝色二极管激光器；$ ?# @4 ]" b  Z; z( z0 m9 P0 K
Alexa Fluor 488——最好的绿色荧光基团；! D& r& L  L! e
Alexa Fluor 546——Cy3 和四甲基罗丹明的替代物；
% {7 }6 |, x( X/ G; ^& KAlexa Fluor 555——优于Cy3 的替代物；
$ D8 L) |& w- `; l2 P& ^. y8 D/ ~Alexa Fluor 647——优于Cy5 的替代品；' N+ J, C1 w; w3 @, T) b
Alexa Fluor 700——远红光二极管激光器的最适染料；
$ {4 F2 g4 U! n! ?( d
6 }& j4 W( Z" E( i有什么问题可以交流，我正在做免疫荧光多标，我不染细胞核，但要染一个蛋白用蓝色DyLight 405 二抗标记，其余为Alexa Fluor 488、Cy3、Alexa Fluor 647。

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作者: 飞翔的十字架    时间: 2011-12-1 23:31

回复 susannajoke 的帖子5 G% D. U! e) N! B
  o8 f+ N# N7 y# F6 p. G
十分感谢！
$ o1 O' u6 [9 y- i/ d请问你是都是一抗＋二抗的方法吗  如果要标记三个，一抗怎么加？! ?- f+ x9 f; U3 K
一起加还是一个一个加
作者: susannajoke    时间: 2011-12-2 01:04

本帖最后由 susannajoke 于 2011-12-2 01:05 编辑 4 ?0 F! q4 b' Q, E: m2 M7 H

, @( l4 D- n7 _我做过的三标染色，二抗种属没有交叉，加入二抗同源的血清封闭，一抗是三种混合在一起4度过夜，二抗是一个一个加，分别洗干净，效果还可以。4 L4 b7 p4 a; |/ x

# R0 v- {, [8 A8 |9 n2 [( @" iJackson公司给的方法是各种一抗与二抗分开加，' V  }+ a! ]' i9 J
例如：1.Donkey Serum 封闭，Goat Anti-Antigen A（一抗A），Probe 1-conjugated" z5 `7 y8 B/ Q7 b" a5 c% t% {3 p
Donkey Anti-Goat IgG（二抗A）；
. W# x1 ?2 D" y. T' y- G+ J% L( ?2.Donkey Serum 封闭，Rabbit Anti-Antigen B（一抗B），Probe 2-conjugated
8 M4 w, R; g* y  P9 uDonkey Anti-Rabbit IgG（二抗B）；3 t1 a" y: g$ z# r7 `
3.Donkey Serum 封闭，Rat Anti-Antigen C（一抗C），Probe 3-conjugated: y: X# V. m+ {" [! x% n, M- r
Donkey Anti-Rat IgG（二抗C）；
! U9 f" F) v# f  C7 l. C请参考http://www.jacksonimmuno.com/technical/multiple.asp
* j# W& V2 H  V7 k这个方法比较费时，可能效果好一些。
6 w5 ?2 O4 Y% }! N% _7 i, h+ Q1 z做多重标记的抗体要求比较高。8 b) N) Q  w/ u1 B% Z1 h4 g  b/ z
5 a7 f3 l4 U7 H# z! ~8 ^+ R/ B
最近我可能准备做上述二种方法的对比，坐下四标，准备学外国实验室的把一抗孵育时间延长2——3天，可能效果会比较好。
! S: c# @% z2 Y0 ]9 @) L用防淬灭剂封片后在我们荧光显微镜下看看有没有阳性表达，在去别的地方用共聚焦照片
作者: 飞翔的十字架    时间: 2011-12-2 13:24

回复 susannajoke 的帖子# q+ U% t9 S, C& v. X& S+ f

; c4 K. k* _7 n1 W+ N不知道你有没有试过直接带标记的一抗  这样的效果和一抗＋二抗比怎么样
作者: susannajoke    时间: 2011-12-2 15:02

有，试过，我以前做三标时候，有个Alexa Fluor 488结合好的抗体。这个是把前面两个一抗过夜，二抗分别加完冲干净后，单独加入这个Alexa Fluor 488结合好的抗体，37度2小时，就可以出结果了。效果其实一样的，就是省了步骤，价格也不便宜，相当于一抗加二抗价格了
作者: siyue13    时间: 2011-12-3 13:20

可怜的，上次买了一个给一抗标记的试剂盒，试剂盒要求抗体浓度1mg/mL,结果买好的抗体浓度太低，标记不上。还是用二抗吧
作者: maomaoma    时间: 2011-12-5 13:37

好的资料，谢谢！



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