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标题: 综合讨论：脐带间充质干细胞的分离，传代和分化的问题 [打印本页]

作者: henryjia 时间: 2011-12-2 08:03 标题: 综合讨论：脐带间充质干细胞的分离，传代和分化的问题

本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 08:04 编辑
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做脐带间充质干细胞的分离有差不多1年了，在此分享一下自己的经验，同时，抛砖引玉，希望大家多提宝贵意见，以完善这个主题研究信息。+ m2 Y: a/ Y0 |5 e

先说细胞分离：比对很对方法后，感觉I型胶原酶联合透明质酸酶消化最理想。但是仍然个体差异性非常明显。而且这个方法不能过扩展到脐带动静血管的消化。
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其次，消化法时掌握不好消化时间，看文献有的说消化过夜，有的说6h的。一直不成功，仍然个体差异性非常明显。过夜消化似乎对细胞损害很大，不知道添加少量血清是否有保护作用。0 f% c1 p, m6 M
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培养基：使用含10%血清的骨髓MSC相同培养基，发现很快（3代左右）细胞老化明显，及时添加bFGF也不能阻止。
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传代：一直使用0.25%胰酶加EDTA（SIGMA），必须要用含血清培养基中和。感觉效果还行。同样有不少细胞贴壁很难弄下来。请问，这部分细胞是不是干细胞？要还是不要呢？0 N( k; s* ]  J7 T0 A; D- U1 k

多分化潜能的功能测试：这是最头痛的，与骨髓MSC相比，结果简直就是成纤维细胞，根本不像MSC。即使之前FACS表面抗原CD90,CD105, VACAM与MSC很接近。成脂成骨作用很弱，不知道大火的结果如何？真如报道的那么好吗？我怎么做不出来？) h' k+ ?  u& K9 Y) A% l
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附上我的细胞照片：
图1是直接贴壁/ j4 a$ {: ?3 m8 Q
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图2是酶消化% ~3 ~+ A& X+ n* j) i
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图3，是否是平滑肌细胞呢？这是我从期待静脉内层剥离的组织消化培养出来的。$ }( B# ]# t/ g
感觉当时是有华通胶混杂其中，但是细胞形态均一。很奇怪。最初目的是分离脐静脉平滑肌细胞。
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作者: 农夫有点田 时间: 2011-12-2 08:23

我只做脐带间充质干细胞的分离没楼主知识面广但是看了您的胶原酶时间消化6h 是不是太长了呢？我做的是不超过60分如果酶是新配的活性很强的话就缩短些个人经验仅供参考

作者: meister 时间: 2011-12-2 08:49

看上去不错。) \, ]. w. H' A; m, [; U
消化困难的也是干细胞，不过形态扁平，比较老化，诱导分化困难，可以舍弃。

作者: henryjia 时间: 2011-12-2 09:03

本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 09:05 编辑 8 {8 v7 i) q/ Y) o2 H1 x
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回复农夫有点田的帖子5 t. r# ~! { y I. v, Y5 S
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我用的胶原酶都是当天配置的（使用浓度1mg/ml or 2mg/ml，溶解于低糖DMEM中），可是消化效果很慢。请问您使用什么试剂配置的呢？我的胶原酶I型是SIGMA买的。

作者: zxiaoxiao311 时间: 2011-12-2 09:11

楼主的图片1和2是在相同倍数下照的吗？感觉酶消化法的细胞要大得多。楼主的细胞三代就开始老化现象，主要指的是什么，长得慢？细胞形态有所变化？

作者: liluli0715 时间: 2011-12-2 09:25

我们组织贴壁也做过二型胶原酶消化脐带，1-3h的消化时间都试过，发现消化时间越长，消化液越粘稠，不容易过滤，需要加大量缓冲液稀释后过滤，离心才能得到细胞。至于细胞形态，觉得组织贴壁得到的梭型细胞多。

作者: sailree 时间: 2011-12-2 10:58

酶消化不是好方法，对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化，形态扁平。

作者: eggnihao 时间: 2011-12-2 12:36

sailree 发表于 2011-12-2 10:58
& D3 f! r- h# K/ Q# ^/ i酶消化不是好方法，对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化，形态扁平。

我现在就是遇到这种情况，传代后细胞扁平，出现老化现象，请问你们是怎么解决这种问题的，有没有其他的方法

作者: wind789 时间: 2011-12-2 14:37

本帖最后由 wind789 于 2011-12-2 14:39 编辑 $ K$ g) {4 q6 s, z
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回复 eggnihao 的帖子2 u7 Z# x4 |7 g8 j! U2 V3 N' H

消化完的果冻用大量PBS稀释，只离心清洗一次。
传代的时候镜下细胞稍变圆就立即中止消化，加入完全培养基，反复轻柔吹打瓶壁。

作者: henryjia 时间: 2011-12-2 17:09

回复 zxiaoxiao311 的帖子
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生长慢，形态变化，变大，不规则

作者: henryjia 时间: 2011-12-2 17:09

回复 zxiaoxiao311 的帖子

生长慢，形态变化，变大，不规则

作者: 农夫有点田 时间: 2011-12-3 12:19

回复 henryjia 的帖子1 k9 x% e, Y9 t) E; j: |' e, C' o

我买的是GIBCO 的直接用去离子水配成1mg/ml

作者: 紫电苍炎 时间: 2011-12-4 23:15

我们这边就是PBS直接配置也是2mg/ml 但是我们这边的笑话时间只有60min！尝试过半小时 1小时 2小时以及过夜笑话！2小时的话细胞得率有增加大概10%的增加相较于1小时，但是隔夜消化的细胞就很少了！

作者: henryjia 时间: 2011-12-5 05:56

回复紫电苍炎的帖子
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60min能够消化完全吗？我尝试过，似乎很难？不知道一些论文中消化后，直接做细胞筛选是怎么实现的？
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发表的论文比较经典的是，酶消化后，比重离心分离单核细胞后，用表面抗体标记细胞，之后进行筛选。这个过程至少要6-8个小时。细胞还能健康吗？我的细胞还没有复苏过来的，很苦闷！

作者: zxcv12345 时间: 2011-12-5 07:12

回复 henryjia 的帖子! s! Z j: U! ^; W* O+ w& g

我们分离osteoblast时，半小时后，取走消化液PBS稀释，样品接着加新酶继续消化，感觉这里也可用这个方法吧。消化时间过长不好

作者: sailree 时间: 2011-12-5 14:52

回复 eggnihao 的帖子1 D* Z2 e2 ^+ ~0 ]( \
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组织块法

作者: 紫电苍炎 时间: 2011-12-7 21:18

回复 henryjia 的帖子' a4 F' r$ `! U! z0 t/ I& D
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不完全是绝对的，话说用不着消化那么完全吧！干细胞增殖能力那么强，只有有些微活细胞就足够了。你说的比重离心我们这边没有做...

作者: henryjia 时间: 2011-12-9 04:53

最经看报道有从大隐静脉外膜提取干细胞，与心血管发生相关。正在尝试。0 D8 U( c* P9 h! y1 u

上周比较了脐带静脉与动脉的消化，发现结果非常不同。相同消化条件下，脐带静脉细胞竟然很少有存活的！

我理解细胞壁厚薄有区别，难道细胞类型也有区别吗？

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