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标题:
请教MII期卵子染色体扩展
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作者:
yahyo
时间:
2011-12-3 12:47
标题:
请教MII期卵子染色体扩展
有哪位大侠做过MII期卵子的染色体扩展吗？我用的是1%的柠檬酸钠通透，接着置于玻片上，逐滴加上10微升的固定液（甲醇：乙酸=3:1），结果卵子经常找不到，不能达到扩展一个卵子染色体的目的。而且几个卵子一起固定时，有些卵子染色体没散开，有些却冲的很散，这是为什么？希望各位能够帮帮我！我的最终目的是能够将一个卵子的染色体有效地扩展在玻片上，不要找不到卵子，谢谢！
作者:
yahyo
时间:
2011-12-4 18:53
论坛里没有没高人指教一下啊？
急！！
作者:
细胞海洋
时间:
2011-12-4 19:35
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yahyo
的帖子
7 t/ s* ]+ O: i$ R- K
, W( I+ K) Z3 E' z
周末人少 再耐心等等吧
作者:
xiaomingxu
时间:
2011-12-5 08:46
楼主的问题真的是一个很棘手的问题，我们也尝试过做MII期卵母细胞核型，但效果也是不理想。
, u i1 T4 W8 I. E, X& F2 ~, b
但可以就一些细节问题进行切磋：我们尝试的方法是，先AT去透明带，PBS清洗，然后，醋酸钠+BSA低渗（可以尝试KCL低渗），TW-20/HCL固定（楼主用甲醇：乙酸=3:1固定确实很剧烈，会发生卵母细胞找不到的情况，所以要尽量控制加的固定剂的量），后面常规操作，遇到的情况与你基本相同，有时可以见到完整的染色体，但有时染色体散的很开，也遇到染色体凝集在一起的情况。改进中......
作者:
yahyo
时间:
2011-12-5 17:15
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xiaomingxu
的帖子
2 @4 \5 j, d' g X
* n3 \1 b- B* G+ Y+ t; a7 r% v
谢谢你的回答！我试试缓和一点的固定方法，请问你有统计固定一个卵子的成功率有多少吗？
作者:
yahyo
时间:
2011-12-5 17:17
论坛里面有做PGD（胚胎移植前基因诊断）的吗？个人觉得临床上的卵裂球原位杂交技术可以参考一下！
作者:
xiaomingxu
时间:
2011-12-6 09:56
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yahyo
的帖子
) P' }& ]& k9 |6 _& q' z7 z0 R
% U- a1 _7 m! P7 B
不知道你所说的成功率是指什么，如果只是看到核，那基本没什么问题的，如果要得到很好的分散染色体，那就比较低，大部分是分散度不好。
作者:
hcluo
时间:
2011-12-6 23:54
本帖最后由 hcluo 于 2011-12-6 23:55 编辑
g' W- i/ G7 { \9 C/ a0 X# j) w
& }( n9 j6 j! o2 J ] i* q
我也最近在做成熟卵母细胞的染色体核型，我得到和楼主差不多的结果，发现加入甲醇和冰乙酸固定液以后，确实对细胞的影响很大很剧烈。我用的低渗液是68nm的KCL, 用了三步固定液，第一步是固定液甲醇：冰乙酸：水=5:1:2，第二步固定液，甲醇：冰乙酸=3:1，第三步固定液是甲醇：冰乙酸：水=3:3:1，最后在载玻片上看到一些没有破裂的卵母细胞，还有很多不见了。所以也来求各位指导。你们也用超排来做成熟卵母细胞染色体分析吗？另外，烤片有必要吗？低渗液浓度是不是太低了啊？
作者:
hcluo
时间:
2011-12-6 23:59
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xiaomingxu
的帖子
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* q" v- D3 m6 m7 ~1 K
请问你用的低渗浓度是多少的啊？时间多少？固定液的浓度是怎么样的啊？具体需要多长时间啊？你是载玻片上固定吗？需要滴片吗？你用的AT是透明质酸酶吗，浓度多大啊，处理到什么程度？
作者:
yahyo
时间:
2011-12-7 13:58
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xiaomingxu
的帖子
2 \( `9 g% n; C( i- E- S8 F9 _ @% a
/ h8 h) b' N4 y( r/ k8 F( m0 R
我说的成功率是看到核的成功率（即10次固定卵子染色体，每次一个卵，有几次可以看到染色体）。因为只有1个卵子，固定过程中容易被冲走而丢失，很容易找不到核，你是怎么标记固定卵子的大概位置呢？能讲下细节吗？谢谢！
作者:
xiaomingxu
时间:
2011-12-9 12:00
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hcluo
的帖子
& ?8 ^! ~" N. g; k# q
% K) t: n! j: X
低渗液：1% （W/V）醋酸钠+0.6%BSA;时间5-10 min；
5 d2 X* n$ `& q+ w9 ]+ U* u3 V
固定液：10 ml 五蒸水中添加10ul的HCL 和10 ul的TW-20;时间要自己把握哦；
* n' \1 i" o$ S. Q
AT是酸性Tyrode，去透明带用的，PH2.5，1min左右即可。
- _! v& Q5 f0 ~7 ?
你们可以尝试一下，然后共同改进哦。
作者:
xiaomingxu
时间:
2011-12-9 12:02
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yahyo
的帖子
: [7 h3 p0 d9 w8 F' O
% O/ r' D a$ B! c" c, c* S
确实遇到这种情况，你可以用玻璃笔在玻片下面画一个很小的圈，然后把卵母细胞转移到其中，体视显微镜下操作。
作者:
hcluo
时间:
2011-12-13 10:11
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xiaomingxu
的帖子
C) U! Z5 V& a) [
: H' G) `2 K, U) e, `
谢谢，准备尝试
作者:
zpzp0312
时间:
2012-2-2 10:29
yahyo 发表于 2011-12-5 17:17
2 n3 z. w* _0 W/ g, f9 ]/ A
论坛里面有做PGD（胚胎移植前基因诊断）的吗？个人觉得临床上的卵裂球原位杂交技术可以参考一下！
% J% w: g$ g# l7 Q
PGD取出的是核不是游离的染色体
7 x$ t6 x; E- T0 R
应该比MII染色体展开要简单
作者:
zpzp0312
时间:
2012-2-2 10:31
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yahyo
的帖子
$ z, v* M: j. Z# E4 ^6 {
( g. {7 J& U' m6 u& I# F$ b% @' U
在镜下仔细盯着
$ V/ i# x) Z( c+ c
否则的确很难找
作者:
zpzp0312
时间:
2012-2-2 10:33
另外再说一下
. O( @1 k* v- d, S# u0 m( |$ F
MII染色体展开确实较难做
) l$ }, A5 E" Z$ G7 r
最好还是一个一个的做
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急！！