干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 请教MII期卵子染色体扩展 [打印本页]

作者: yahyo 时间: 2011-12-3 12:47 标题: 请教MII期卵子染色体扩展

有哪位大侠做过MII期卵子的染色体扩展吗？我用的是1%的柠檬酸钠通透，接着置于玻片上，逐滴加上10微升的固定液（甲醇：乙酸=3:1），结果卵子经常找不到，不能达到扩展一个卵子染色体的目的。而且几个卵子一起固定时，有些卵子染色体没散开，有些却冲的很散，这是为什么？希望各位能够帮帮我！我的最终目的是能够将一个卵子的染色体有效地扩展在玻片上，不要找不到卵子，谢谢！

作者: yahyo 时间: 2011-12-4 18:53

论坛里没有没高人指教一下啊？

急！！

作者: 细胞海洋 时间: 2011-12-4 19:35

回复 yahyo 的帖子

周末人少再耐心等等吧

作者: xiaomingxu 时间: 2011-12-5 08:46

楼主的问题真的是一个很棘手的问题，我们也尝试过做MII期卵母细胞核型，但效果也是不理想。% Y. g7 z6 R& |/ s
但可以就一些细节问题进行切磋：我们尝试的方法是，先AT去透明带，PBS清洗，然后，醋酸钠+BSA低渗（可以尝试KCL低渗），TW-20/HCL固定（楼主用甲醇：乙酸=3:1固定确实很剧烈，会发生卵母细胞找不到的情况，所以要尽量控制加的固定剂的量），后面常规操作，遇到的情况与你基本相同，有时可以见到完整的染色体，但有时染色体散的很开，也遇到染色体凝集在一起的情况。改进中......

作者: yahyo 时间: 2011-12-5 17:15

回复 xiaomingxu 的帖子# K: M4 B# T y( Q9 t2 y1 V. m! A) U
$ j% ~7 ^/ }8 }# v
谢谢你的回答！我试试缓和一点的固定方法，请问你有统计固定一个卵子的成功率有多少吗？

作者: yahyo 时间: 2011-12-5 17:17

论坛里面有做PGD（胚胎移植前基因诊断）的吗？个人觉得临床上的卵裂球原位杂交技术可以参考一下！

作者: xiaomingxu 时间: 2011-12-6 09:56

回复 yahyo 的帖子

不知道你所说的成功率是指什么，如果只是看到核，那基本没什么问题的，如果要得到很好的分散染色体，那就比较低，大部分是分散度不好。

作者: hcluo 时间: 2011-12-6 23:54

本帖最后由 hcluo 于 2011-12-6 23:55 编辑
/ K' [5 _' Q+ ?( w* P8 Q* S' P4 z" r
我也最近在做成熟卵母细胞的染色体核型，我得到和楼主差不多的结果，发现加入甲醇和冰乙酸固定液以后，确实对细胞的影响很大很剧烈。我用的低渗液是68nm的KCL, 用了三步固定液，第一步是固定液甲醇：冰乙酸：水=5:1:2，第二步固定液，甲醇：冰乙酸=3:1，第三步固定液是甲醇：冰乙酸：水=3:3:1，最后在载玻片上看到一些没有破裂的卵母细胞，还有很多不见了。所以也来求各位指导。你们也用超排来做成熟卵母细胞染色体分析吗？另外，烤片有必要吗？低渗液浓度是不是太低了啊？

作者: hcluo 时间: 2011-12-6 23:59

回复 xiaomingxu 的帖子

请问你用的低渗浓度是多少的啊？时间多少？固定液的浓度是怎么样的啊？具体需要多长时间啊？你是载玻片上固定吗？需要滴片吗？你用的AT是透明质酸酶吗，浓度多大啊，处理到什么程度？

作者: yahyo 时间: 2011-12-7 13:58

回复 xiaomingxu 的帖子
% S) K9 ?! e+ Z8 K0 K5 o
我说的成功率是看到核的成功率（即10次固定卵子染色体，每次一个卵，有几次可以看到染色体）。因为只有1个卵子，固定过程中容易被冲走而丢失，很容易找不到核，你是怎么标记固定卵子的大概位置呢？能讲下细节吗？谢谢！

作者: xiaomingxu 时间: 2011-12-9 12:00

回复 hcluo 的帖子

低渗液：1% （W/V）醋酸钠+0.6%BSA;时间5-10 min；; R* m( o$ o: s5 E
固定液：10 ml 五蒸水中添加10ul的HCL 和10 ul的TW-20;时间要自己把握哦；" J) U7 H) a. j0 O& k" b
AT是酸性Tyrode，去透明带用的，PH2.5，1min左右即可。0 |8 h: K3 N& N: A3 }- B, I7 w
你们可以尝试一下，然后共同改进哦。

作者: xiaomingxu 时间: 2011-12-9 12:02

回复 yahyo 的帖子& w' _9 t* [0 p* T6 s

确实遇到这种情况，你可以用玻璃笔在玻片下面画一个很小的圈，然后把卵母细胞转移到其中，体视显微镜下操作。

作者: hcluo 时间: 2011-12-13 10:11

回复 xiaomingxu 的帖子
. p/ `* v8 \) n/ w, ]- j6 N6 {& p
谢谢，准备尝试

作者: zpzp0312 时间: 2012-2-2 10:29

yahyo 发表于 2011-12-5 17:17
' C) D0 H: r/ ^/ O- j7 m论坛里面有做PGD（胚胎移植前基因诊断）的吗？个人觉得临床上的卵裂球原位杂交技术可以参考一下！

PGD取出的是核不是游离的染色体& ]# c/ K Y; t/ `0 h' S
应该比MII染色体展开要简单

作者: zpzp0312 时间: 2012-2-2 10:31

回复 yahyo 的帖子

在镜下仔细盯着
否则的确很难找

作者: zpzp0312 时间: 2012-2-2 10:33

另外再说一下
MII染色体展开确实较难做' W& {% k. W4 r+ s, d9 A" m
最好还是一个一个的做

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)