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标题: 请帮忙分析下RNA电泳结果 [打印本页]

作者: jiojoo 时间: 2011-12-4 21:55 标题: 请帮忙分析下RNA电泳结果

本帖最后由 jiojoo 于 2011-12-4 21:59 编辑 & ]$ B- y$ J9 ^6 a. @' c

提取了RNA，吸光曲线显示RNA非常纯
但是电泳结果如图所示，感觉似乎降解的比较严重。
我电泳用的是普通的1%琼脂糖凝胶，不是变性电泳
那些弥散状的东西是因为电泳不是非变性凝胶才产生的吗？) f, R) c* t9 n" b# S- d$ C- d
最下面最亮的是5s还是降解的RNA碎片？8 _' a- k& j, P+ e3 q% |4 B6 O4 r

" R" B+ `7 q; y1 J% d

H# _0 C* U* r4 K9 U7 [
28s上面还有一条带，是基因组DNA吗？
之前好像记得哪里说过，实时定量PCR对RNA纯度要求很高，反而对RNA完整性要求不高。
如果只用来做实时定量PCR，这种降解程度是不是不会对结果产生影响的？
忘各位前辈不吝指教

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作者: susuloveq 时间: 2011-12-4 22:29

1%琼脂糖凝胶太小了，我都用2%多的胶跑，我建议你先用来做下内参咯，内参没问题的话就没问题了，降解有很多方面的原因的

作者: susuloveq 时间: 2011-12-4 22:31

还有你不要跑太久了，跑十几分钟看到两条带即可，跑太久RNA也会降解的，电泳槽也不太干净的

作者: 星移龙一 时间: 2011-12-4 22:52

是降解啦，下图有一部分可以用，但上图太差啦，最前面的是降解的。
而且我要说一下：susuloveq的说法我不赞同，我们每次的凝胶浓度是0.7%，这样可以快。

作者: zxcv12345 时间: 2011-12-5 07:09

回复 jiojoo 的帖子; i) Y( j: M6 ~5 [

从图片上看：
有RNA降解+ S! O) H7 A' s6 u$ Q; s" u
还有明显的DNA污染

作者: 歪歪 时间: 2011-12-5 08:50

建议消化DNA后再跑胶，RNA有些降解对你实验影响不大，但DNA污染做出的结果就不好说了。

作者: cneagle66 时间: 2011-12-5 09:16

下图中间三条带的RNA还可以，虽然有降解（一般28S应该更亮），但是还可以用，其他的标本，降解严重，如果对实验严格要求的话，这样的RNA最好不用。
DNA污染：对于一般的RT-PCR来讲，设计引物的时候，可以横跨两个外显子，避免了DNA的干扰。对于荧光定量RT-PCR，我觉得也可以这样，比如我曾经用的SYBR green，它的扩增片段长度可以在200bp左右，完全可以找出横跨外显子的引物来。至于用探针的荧光定量PCR，我没有做过，没有深究过它的原理，因为扩增片段只有几十个碱基，可能设计跨外显子的引物比较困难，但也可以一试，不知道行不行。

作者: ilovelife 时间: 2011-12-5 10:10

还是要跑变性胶，否则RNA的二级结构导致你没法判断哪条带是什么。

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-5 10:40

最上面那个应该是基因组污染，最下面的应该是5S带，感觉您这个RNA提取效果不是很好，RNA降解很严重，如果正常情况下，5S不会太亮，很亮的应该是18跟28S，另外，28S应该是18S的两倍亮是比较好的，还有就是如果做定量的话，RNA降解会有影响，但是有DNA污染比RNA降解影响更大，有基因组污染会严重影响定量结果。不知道您是用试剂盒提的还是直接用TRIZOL，还有，不同品牌的试剂盒提取效果差异很大，另外，您一次提了那么多样么？一次提太多RNA降解严重是肯定的，建议提RNA一次还是少提几个样，操作时间太长，会使RNA降解的

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-5 10:44

RNA跑胶最好还是用变性胶，但是如果不用变性胶的话，胶中加点氢氧化钠也会使得图片好看点，胶的浓度对于跑胶结果，个人觉得没太大影响，胶浓点就少跑会，稀点就跑时间长点，跑胶这么短的时间不会说就使得RNA降解的，RNA降解主要还是在提取过程

作者: jiojoo 时间: 2011-12-5 17:14

回复 cneagle66 的帖子

我在做RT-PCR之前都会用DNaseI消化DNA的，这样DNA应该可以去除干净了吧？
另外，我的目的是检测mRNA的表达水平，用Radom引物有没有问题？因为照原理来说，Oligo dT引物应该更好。; b. C8 _9 D3 p" E+ j, f* p8 x
上面那块胶中的样品，我做PCR得出的结果还是非常稳定的降解严重和不严重的结果都差不多。

作者: jiojoo 时间: 2011-12-5 17:23

回复 huangcong1988 的帖子+ P$ I: d. r' C/ ^) h# A
$ M4 |1 z* E% h( h: _3 S! P q; O
感谢回复
我用的是Omega的RNA提取试剂，类似Trizol的试剂。这些是分次裂解于裂解液中，冻于-20度几天后再一次性提取的。
还有些问题请教0 u: z" X9 V8 I
基因组的话，为什么是很单一的一条带呢？不是应该是一条弥散的带吗？+ p+ l+ w6 K" H) N/ T
Fermentas的DNaseI消化DNA后样品的DNA污染应该可以消除了吧？
反转录后还需要用RNaseH去除RNA吗？

作者: jiojoo 时间: 2011-12-5 18:48

回复星移龙一的帖子& o/ ?; N) ]/ j# G0 ?: [

凝胶的问题会不会出现这种情况？ Z; `! c1 \; M9 P
我们这里是刚开始做生物方面的实验，之前我一个同学配胶时用的水而不是TAE
结果就是一条弥散的带，像降解了一样
然后他又用TAE来配，又跑了一次，结果RNA完整性其实是很好的

作者: jiojoo 时间: 2011-12-5 18:51

回复 huangcong1988 的帖子
( G7 i6 I6 A) U- r0 z4 T1 e* S n
感谢回复 F2 r U5 X% {9 X$ g9 Q
NaOH怎么加？需要加多少？NaOH的效果是不是也是使RNA变性？还请指教
另外，胶浓的话应该是多跑一会儿吧？

作者: xfyangsibs 时间: 2011-12-5 19:11

降解严重，DNA污染同样严重。降解，，，，防降解的法子都用上，DNA除一下就行了

作者: 星移龙一 时间: 2011-12-5 21:15

回复 jiojoo 的帖子
. K O* {3 d/ T/ H. B0 G9 \
会啊，如果你用的水不太好，很容易在电泳过程中导致RNA的降解。

作者: zhaoyan1983 时间: 2011-12-5 22:10

我感觉如果只是实时定量PCR的话应该是可以用的，但最好有内参另外点样太多有可能在你最后一个孔点样之前前边几个就有部分降解了也说不定 RNA太小最开始点样之后最好大电压跑一下让RNA全部进到胶里边所以感觉不一定是你提的不好可能是跑的过程中降解了

作者: cneagle66 时间: 2011-12-6 08:32

jiojoo 发表于 2011-12-5 17:14
$ m- h, \+ T. E1 r. z2 D回复 cneagle66 的帖子* F" N. i/ y& v$ ^: ^. S! @; b! G
8 [/ [4 S, O* U, x
我在做RT-PCR之前都会用DNaseI消化DNA的，这样DNA应该可以去除干净了吧？

DNase消化是很常用的办法，应该是很好的去除DNA污染的办法，严格的实验都要求将DNA去除。" q0 s6 Z5 Y" U
对于哺乳动物RT反应，用Oligo dT或者随机引物都可以。我前面说的引物设计问题，是指在PCR那一步，普通的RT-PCR可以通过设计横跨两个以上的外显子，来避免DNA污染所造成的扩增，因为DNA扩增出来的片段很大，或者因为内含子很长，从DNA扩增效率很低或不能扩增。但是对于荧光定量的RT-PCR，我不知道是不是也可以这样。至少我用sybr green的时候我是这样设计的，因为它不用探针，而且PCR产物较长，在一个大的范围内比较好挑选PCR引物对。但是对于用荧光探针的定量PCR，我没有经验。

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-6 08:33

回复 jiojoo 的帖子
- H7 p1 S& l: I2 K: b( Q
冻在负20数天？个人觉得可能冻在负80更好

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-6 08:35

回复 jiojoo 的帖子! U/ B; w8 e f0 y j6 `
B3 k+ B: l3 L+ ]1 r* w
我最近也遇到同样的问题，正在尝试解决的方案，就是用Fermentas 逆转录试剂盒里面的DNase 除掉提的RNA里面的质粒

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-6 08:37

回复 jiojoo 的帖子

恩，对，胶浓点就多跑会，胶稀点就少跑会，氢氧化钠其实加多少没有硬性规定，我一般就跟加EB一样，加一滴，浓度其实低点无所谓

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-6 08:38

回复 jiojoo 的帖子

没有，你提组织或者cell 总DNA的话，跑胶检测，你看到的是弥散的带？

作者: cneagle66 时间: 2011-12-7 08:33

加了TRizol的裂解液，按照说明书要求，是要放进-80度冰箱保存的，它的目的是要长期存放，比如一个月。不过，我曾经因为操作失误，放进-20度冰箱中一周，后来又提取RNA，效果没有什么不同。所以短时间-20度存放，应该还可以。

作者: ielisa 时间: 2011-12-8 14:58

RNA的完整性对实时定量的结果影响很大的，你的RNA降解很严重，应该是在操作过程中发生的降解，你是试剂盒抽提的，要么就是你一次抽提的样本多，时间间隔过长造成了降解，要么就是你进行试验时用的枪头啊，试剂啊含有RNA酶，建议试验开始前一定要做好准备工作。跑胶的浓度1%就可以了，跑胶的时间也不长，这个过程的降解微乎其微，不用变性电泳了。

作者: cronos0910 时间: 2011-12-11 19:04

这样的RNA sample还是可以用来跑real time PCR，做之前建议加DNase，因为你的TRIzol跟choloroform那步没做好，有明显的DNA污染，另外如果你想要准确点的real time PCR的结果，可以在目标基因的5'跟3'都设primer，做double check，如果还有问题，欢迎提出来一起讨论

作者: linzi214 时间: 2011-12-12 16:01

1.5%琼脂糖凝胶电泳10~15min就好，每个孔上样3~5ul RNA量，不要电泳太久。一般OD值测出来结果比较好的话，我们实验室只在第一次跑电泳鉴定抽提效果，后来直接做QRT，效果一样好，不过最好每次都电泳看一下

作者: linzi214 时间: 2011-12-12 16:07

本帖最后由 linzi214 于 2011-12-12 16:11 编辑
7 R9 a( S7 l; z& T: u' J+ u
也可以将RNA和DNA电泳系统分开来用。RNA最好抽提定量后就先逆转录一批cDNA，然后保存在-80oC，这样不容易降解，逆转录为cDNA的样本更易保存。

作者: jiojoo 时间: 2011-12-17 19:50

回复 cronos0910 的帖子

感谢回复/ d. H6 R# C! J
Trizol和Choloroform这步有什么问题会导致DNA污染呢？
Trizol裂解时间不够？Choloroform加的过量或过少？: @5 ^, k; M* f; {6 @" U; @$ o
还请指教4 T+ d4 b6 P" G. [- X1 K$ C [
谢谢

作者: linzi214 时间: 2011-12-21 16:36

加入Trizol吹打混匀后室温放置5min，加入氯仿颠倒混匀至分层液体变为均匀的小的粉色油状颗粒，总之一句话充分混匀，然后静置10min至分层，离心。离心后转移上层清澈液体即RNA至一干净EP管中，注意不要吸到白色的中间层。一帮情况下这样做是OK的。你再试一下，宁缺毋滥，再保证RNA量的情况下，还要主要RNA的纯度。

作者: jiojoo 时间: 2011-12-21 23:26

本帖最后由 jiojoo 于 2011-12-21 23:27 编辑

回复 linzi214 的帖子8 M; b( r% v6 R# _6 W
/ q" @# O1 P" K4 T- w; r) l. O
感谢！
我现在提取的RNA纯度是非常好，浓度也能满足需要
只是降解性一直没得到很好的解决，我用的EP管和枪头都是AXYGEN的，说是无RNase的2 |* C' ^8 b: L8 ~& X3 b2 K
我都是直接用，别人也这么用，也没出过问题
有点不同的就是我的细胞量比较少，只有约20到30w
4 p- |4 A4 w+ m& u
此外，最近又出现DNA污染的问题，不知哪些情况会导致DNA的污染？是Trizol裂解的时间不够吗？

作者: linzi214 时间: 2011-12-22 08:51

抽提RNA用的PBS、ddH2O都用DEPC浸泡过夜，高压预冷后用。枪头可以用DEPC水浸泡后高压或直接买DNase/RNase-free的枪头，在抽提过程中要戴口罩，带干净的乳胶手套，如果接触其他东西的话喷一下酒精。操作台面和加样枪用酒精消毒后再用。一般没有问题的

作者: 不倒翁 时间: 2011-12-22 09:05

降解了不会有碎片的还有跑的时候电压调高时间尽量短

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