干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 求助！免疫组化测肿瘤组织CD133，阳性率太高怎么回事。 [打印本页]

作者: 胖兜宝贝 时间: 2011-12-8 20:54 标题: 求助！免疫组化测肿瘤组织CD133，阳性率太高怎么回事。

我用SANTA CRZU公司的CD133单克隆抗体测的，CD133阳性率20%左右，在阳性的标本里面，无一例外都是高表达强度。
按照文献，肿瘤干细胞阳性率应该在1%以下，可是我做出来的阳性病例全是下图这样的，大量表达CD133.- e, L3 X1 `, L. d
[attach]36557[/attach]
请教大家，会是什么原因造成的。

作者: cneagle66 时间: 2011-12-9 08:46

Santa 的抗体阳性率高是出了名的，建议更换抗体试试，比如cellsignal、sigma的，注意不要买到假冒的。

作者: gandanxiaoyang 时间: 2011-12-9 09:24

以前用的是美天旎公司的CD133抗体。7 Z; t7 ?1 o! h
需要提醒的是，美天旎公司抗体说明书上说，最好是用冰冻组织的切片做。
而且好像对修复液有特殊要求。看图片好像染色多位于细胞核中，所以染色特异性有待于进一步确定。+ [: f* B! L3 y/ @+ C+ d% C
如果不能肯定，可以先做几张冰冻切片，应该会好很多。

作者: ljs 时间: 2011-12-9 10:07

1.把阴性对照的图片传上来，先看阴性对照。
2.你用的修复方式是什么？不同的修复方式及修复方法对阳性结果有很大的影响0 p& y' M) j; o! ~
3.染色时间是多久？6 u* r; V# n" |) F- D% E
4.一抗、二抗的孵育条件是什么、种类属别别搞错。0 p6 n7 w' |' c* h/ V+ K0 |
总之，综合以上的问题，把各个条件优化到最佳。你的实验仅仅是刚开始，没有优化，出现假阳性有可能。

作者: 胖兜宝贝 时间: 2011-12-9 11:04

回复 cneagle66 的帖子

实验经费不够了，这个抗体花了2800买的。

作者: 胖兜宝贝 时间: 2011-12-9 11:16

[attach]36584[/attach]
这是阴性表达的。8 r r }' R/ i0 |& z
修复方式是高压修复。
染色是用了Elivision plus试剂盒，一抗在37度下孵育1小时，二抗在37度孵育20分钟。

作者: 胖兜宝贝 时间: 2011-12-9 11:20

gandanxiaoyang 发表于 2011-12-9 09:24 ) x+ F; X3 Z! E$ |
以前用的是美天旎公司的CD133抗体。 v w$ d0 o7 ]0 x% @% q$ |" u
需要提醒的是，美天旎公司抗体说明书上说，最好是用冰冻组织的切片做。 ...

是的，基本上都是核染色，按道理是应该胞膜阳性的。但是还有不少阴性的病例。为什么有少数标本表达强度那么高，但是还有很多病例完全没表达呢？

作者: 胖兜宝贝 时间: 2011-12-9 11:22

ljs 发表于 2011-12-9 10:07 ( T# G7 }- `6 q3 r
1.把阴性对照的图片传上来，先看阴性对照。0 \3 l& j2 W' p' [% Y2 T
2.你用的修复方式是什么？不同的修复方式及修复方法对阳性结果 ...

% c( n* k6 y9 o' l
我在论坛里看到有人说这种情况可能是抗体浓度过高造成的，请问有这种可能吗？

作者: ljs 时间: 2011-12-9 14:53

抗体浓度过高造成的，有这种可能！！& X2 x7 U1 \9 _0 Q7 |
实验条件摸索的建议如下1 ~! w/ F9 U1 ?0 ]# y D# k5 S
1.一抗反应条件4度过夜，设置好不同的浓度梯度
2.可以试试不用高压修复，或者减少高压修复时间，看看效果。$ Y: k. C9 ^) U2 W# V
3.最后的显色时间、显色液的浓度应该降低。
根据你提供的信息，这个抗体的阳性部位在细胞膜，针对抗体的建议如下：
1.更换抗体，从其他的单位找到这个抗体和阳性病理切片，即阳性片，国内很好买到，做着看看，应不成问题，没多少钱。经费不够不是理由，大不了自己掏钱。6 s8 S1 X5 X; r
2.联系santa售后服务，要他们来解答。

作者: 胖兜宝贝 时间: 2011-12-9 16:14

ljs 发表于 2011-12-9 14:53
1 A% X/ R( M* r* ^7 \" A抗体浓度过高造成的，有这种可能！！
: Z ^6 E# e! k, w8 o% @1 D实验条件摸索的建议如下
, m1 U+ n" ~: Q" g* `* `1.一抗反应条件4度过夜，设置好不同的浓度梯 ...

( f$ m3 x) a }- S
谢谢，我按照你的建议再试试看

作者: 279042256 时间: 2011-12-12 15:43

我感觉有几种可能：
1.一抗浓度过高
2.修复过度，可以试试温和修复如蛋白酶k修复试试
3.显示时间过长或染色液难度过高
有问题可以随时问售后或者干脆换个抗体试试

作者: pharmD 时间: 2011-12-24 17:48

SANTA CRZU公司的质量到底行不行啊？

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)