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标题:
急 加急 火急
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作者:
fwyou
时间:
2011-12-12 15:57
标题:
急 加急 火急
我有完全互补的上下游寡核苷酸 想退火使其互补
5 p% Z+ K: m6 [. n; p1 a. S- t9 _
# Q: m, e( g" Y& p
具体步骤是什么？群友帮忙一下吧
作者:
cneagle66
时间:
2011-12-12 16:10
95℃ 5 min, 然后每降低1℃保持90s, 直至降到30℃, 维持30min, 随后再降至4℃后, -20℃保存。
作者:
cneagle66
时间:
2011-12-12 16:13
方法二
9 z+ m4 M) `; X1 ~9 h! ~ x+ W
1.退火。退火buffer：10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA。
1 I3 [+ g: o) H X6 w
退火体系：两条寡核苷酸片段各2µl(1µg/µl)，1×退火buffer 46µl。
0 a( Q$ ~2 M5 b( I- y- O7 ], a
95℃ 5min,然后自然冷却到室温。
* Q! v; x# N& s+ G! d8 x
2.载体酶切，回收（按照正常）
0 K4 U1 K |6 |9 O& j. k3 g" W( O# v# J
3.连接。
( o# L1 u% [8 F4 p+ }' h& ]8 p; m
2 ?' u- V) V7 K+ i) i
方法三
4 L' ^; {- o$ {1 s. G8 }1 q6 J9 }
退火条件（供参考）：
; ~ ~. P" n, M, r6 R, q8 w
99℃ 2min
8 ^9 i; ~" L5 f, V
72℃ slow down 30℃ 90min
7 k$ z) G8 U ^' `
4℃保存
- N, T: m' J' G2 H2 K) r; m3 T
作者:
hndxws
时间:
2011-12-12 17:16
楼上的可以做到，但是做实验的时候不用那么复杂。我做的时候是95度5min，然后直接自然冷却至室温就可以了，也是没问题的。我曾经这样做shRNA的克隆
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