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标题:
为什么病毒转染效率高，却不能感染相同293t细胞？
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作者:
wangsandan0503
时间:
2011-12-28 10:41
标题:
为什么病毒转染效率高，却不能感染相同293t细胞？
2011-12-28 10:38 上传
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近日包病毒，用pei转染方法转染，24小时观察荧光，如图所示，但是为什么感染293t细胞却没有出现荧光？请大家分析讨论一下，谢谢
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http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MzczMTR8NWYwMTcyNTR8MTc0ODExNjkxOHww
作者:
Yedan
时间:
2011-12-28 11:06
包的什么病毒，辅助质粒是什么，确定是能感染人的细胞的辅助质粒？
/ U& o3 W" J6 c
最后，说一句废话：LZ包病毒的时候加了辅助质粒吧。。。
作者:
rexhz
时间:
2011-12-28 13:12
转染后收集的病毒上清的话滴度不高。这过程有很多因素，比如换液时间，转染完用的血清的量，质粒加入的量。
6 A+ c. `! ~ I) W `
你这个荧光很亮的话，而培养液上清没有滴度，可以考虑缩短转染完换液的时间，还有增加一些辅助质粒的量。
$ W9 M& H" M% d' O' X$ b8 M
问下楼主，你用PEI来转染是转293还是293T,我看到的都是转293的，
3 s7 z# r9 Q5 T/ `
还有能否提供PEI包病毒的protocol?
作者:
sizhengliu
时间:
2011-12-29 10:41
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rexhz
的帖子
2 q+ q. A" H2 A# ^% I
; |9 v3 y' R( e! f* l# @2 U' T
你好！转染前后培基中血清比例有不同吗？你一般用多少？
作者:
zzyhelixinxin
时间:
2011-12-31 09:34
不知道你感染293T细胞后，多久观察的，我们一般都是病毒感染3~4天后倒置荧光显微镜观察感染率。你所用的病毒滴度是多少？这些条件都要考虑的！
作者:
cicadacjk
时间:
2011-12-31 10:47
首先确定你包了病毒
0 J, k- _; w- F
其次确定你的病毒能感染人的细胞（单嗜逆转录病毒不感染人细胞）
, p7 H* S6 A8 i6 w
然后，建议你换转染试剂，我做过test，PEI包病毒效率非常差，远低于Fugene、Lipo、钙转（这三个依包被效率排列）。PEI我们一般用于瞬转表达
作者:
xiaoyurly
时间:
2011-12-31 11:42
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wangsandan0503
的帖子
- V D7 g$ I! T2 ^4 O* Q+ u
$ ^6 m8 a( B# w0 B7 p
读了两次才弄明白是293T包出的病毒再转染293T无效率，瀑布汗~
8 }+ S" d% p5 S' T8 f) f
不知你用的辅助质粒是哪个？VSV.G是能够感染人源细胞的么？
/ k9 y/ d: w" U8 U6 P2 g
包装病毒时各质粒的配比？转染时病毒与细胞的量比关系？？
0 |) C/ _. }3 n% h
有没有用这个病毒转染个3T3之类的鼠源细胞？
% C* v: I0 W7 h& a. B: K( `; c; @" M
病毒制备需要注意很多细节问题，希望能说清楚些，才好从中找到原因
作者:
wangsandan0503
时间:
2011-12-31 14:04
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zzyhelixinxin
的帖子
% j& }) n" L: M! r& N/ }$ ]! u! S
6 C% H N2 @5 n
感染293t细胞，我们也是倒置荧光显微镜观察，您说3-4天之后才照荧光吗？
作者:
wangsandan0503
时间:
2011-12-31 14:06
本帖最后由 wangsandan0503 于 2011-12-31 14:15 编辑
: p% N' i9 V7 x/ b5 Q
3 @$ a# j: f# V9 J; l0 T. h
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rexhz
的帖子
: P% m" D. ^$ U+ i" T7 S
& e1 V! y! ?/ o7 J9 C
下面是我的详细步骤，希望大家不吝赐教，谢谢。
# I: P2 a4 Z+ S% O1 s
1. 稀释质粒为1µg/µl
' [& e1 b+ \8 G1 b
2. 按照包装体系rev:gag:mcs:vsvg=1:3:1:1比例分别加入质粒
) j7 B, c0 |0 D7 U7 s
3. 加双无培养基
: M, h T O/ E
4. PEI4倍体积：质粒1倍体积
5 T/ }6 E- l) i
5. 室温混匀，静置10min
! D+ Q2 y& [* y& L3 C
6. 给293T细胞换液
" B( i% j9 }- c; W! x: @
7. 加入混合物于293T细胞（计时间）
# L; a( p& @/ M! M7 ~$ H. u7 n
8. 8小时后换液，换新鲜双全培养基
6 m' a! T$ v3 L
9. 转染后60小时收毒于一个细胞离心管中
* E9 X- G$ y# N
10. 离心5000转 5min
8 z0 ^- h* T& J. S" S
11. 用45μm的滤网过滤到一个个EP管中
5 ?; x( S9 F. M; O
12. 加入500µl过滤的病毒液（上清）条件合适的293T细胞培养皿
& I! u5 `; d% [! q
13. 8小时之后给293T细胞换液
9 E/ l; y& R9 n V8 J# U* f
14. 24小时之后荧光显微镜下观察转染情况
9 J% F1 E7 M4 f- e
作者:
momocy
时间:
2011-12-31 14:12
我也试过唉，就是293T细胞包装出来的病毒感染293T细胞，结果没什么GFP，而之前转染的时候GFP都是很亮的，也很疑惑
作者:
wangsandan0503
时间:
2011-12-31 14:18
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momocy
的帖子
% {; F$ g, C9 }' X7 I; O& i `6 D1 F
! ?) R7 C, |5 j* H. K& S
对，这个问题是什么原因呢？
作者:
wangsandan0503
时间:
2011-12-31 14:18
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xiaoyurly
的帖子
j* i: y& Z5 `
. F" |6 H( d) O. r5 V g
你好 我的详细步骤 在9楼 请多多指教
作者:
wangsandan0503
时间:
2011-12-31 14:20
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cicadacjk
的帖子
* ^3 p7 R+ p& ~3 D% c( b
5 }9 P* T) B+ ]5 m3 E+ A
可以确定可以感染人的细胞，lipo2000转染效率高吗？
作者:
rexhz
时间:
2011-12-31 14:32
可以试试钙转的.我们用293T做钙转都很好。我看到文献用PEI产病毒都是用293来做的，而且是悬浮培养
作者:
ellapan
时间:
2012-1-3 04:36
ok 我虽然采用的是cacl的方法，但是估计道理想通，我感觉你换液的时间8hour却是不合适，我们一般都是24 hour的 不知道是不是不同方法之间差异？
作者:
xiaoyurly
时间:
2012-1-4 10:35
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wangsandan0503
的帖子
! @* A, J/ Q' l, a
1 c# b: Z% g5 u2 ~! m
这个方法还不是特别详细，不知你用多大盘的细胞来包装病毒。PEI与质粒的用量又分别是多少？PEI有一定细胞毒性，我们用它转染细胞时孵育4-5h即换液，做病毒时一般48h收集，病毒上清液1500rpm离心然后过滤。病毒转染时加polybrene 4-8ug/ml，5h后换液。病毒再转染293T时是多大孔板？有用其他细胞验证过吗？病毒转染后有没有观察更长的时间如36h、48h等？病毒液好像没有超离心浓缩，只有病毒滴度特别高的时候才可直接转染，否则还是浓缩一下效果比较好。
4 E0 Q4 |! b6 J1 C2 M
如果还是不行的话就换磷酸钙法或者其他转染试剂吧。
作者:
kongpzh
时间:
2012-1-26 21:12
有荧光并不代表病毒包装成功。荧光只是质粒转染进去的标志。
3 J5 c m" f8 d
病毒包装成功还需要很多其他的因素，比如质粒之间的比例、细胞状态等。
: b+ P# k( \* i+ R
如果病毒包装的滴度很低，那很可能就出现你这种现象。
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近日包病毒，用pei转染方法转染，24小时观察荧光，如图所示，但是为什么感染293t细胞却没有出现荧光？请大家分析讨论一下，谢谢
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