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标题: 有关慢病毒的制备富集及检测的讨论（待续） [打印本页]

作者: ellapan 时间: 2012-1-3 04:13 标题: 有关慢病毒的制备富集及检测的讨论（待续）

本帖最后由 ellapan 于 2012-1-3 04:15 编辑 . E0 x# w  Y" i- m" G; _5 t/ |! X
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序言：有一段时间没有来这里冒个泡了，主要是实验进展很是紧张，然后又赶上merry christmas和boxing day难道休息下来，于是决定趁着打折日疯狂的shopping一把，然后狠狠的在家窝着修炼（睡觉），呵呵功夫不负我这样的有心人，一口气淘了不少什么好东东，甚至把2012回国的礼物都买的基本齐备了，也算了结一个心事。（建议下在国外的各位，或是12年要出来的各位，一般来说北美这边商店打折的日子一年就一次，就是boxing day，如果可能还是把想买的一年的衣服电子产品呀什么一起买了，实在是省心不少）
ok，言归正传，还是说说慢病毒的事，慢病毒的包装制备技术现在基本已经作为像PCR扩增一样普通和流线化了，可是还是有不少的实验室和同学在制备和后续的检测过程中会出现不少的问题，本人也是，约两个月前本人开始接触此领域并开始制备携带自己目的序列的靶病毒，一路走来在实验室各位的帮助下，总算达到基本合格的水平，可是仍然心中有不少的confusion。( ?. [! L" c& b( \+ u
在此也只是想抛砖引玉，一方面整理各大牛人的“神贴”，总结别人的经验给自己也学习之长，另一方面我看本论坛一直没有系统的整理的帖子，所以斗胆献丑了：( p3 l( J5 P3 B+ _0 g8 h
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“泡沫清风”大侠的“宝宝一号”神贴，对于freshman可谓是葵花宝典，从简单的细胞系的复苏到传代，到转染后荧光的观察都是很是仔细，各位可以参阅：                      http://www.stemcell8.cn/thread-13340-1-1.html  （赞美的话不多说了，谈几点遗憾，一是泡沫清风没有上传具体的protocol献给各位；二就是可能是自己的结  果过于完美，反而搞的大家只能膜拜仰望之，其实中国有句古话说失败是成功他妈，所以相对新手来说从失败的案例中汲取的教训可能更有效的指导实践，呵呵  一家之言）
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常见问题
（1）小刘同学的问题：
各位好！我用3代4质粒系统（PLP1,PLP2,P-VSVG,融合EGFP载体质粒）同时转染到293FT（35mm皿）中，可以见到比较亮的荧光。但是在转染后48h和72h分别收集上清进行滴度测定（293FT铺24孔板），每天观察，4天内连一点荧光的影子都见不到！我不知道是哪里出了问题？路过请指教！# H: c3 I4 {  _" h/ I, J+ J5 q( }
      “感染病毒过程是什么样子啊？加入多少病毒液，，细胞状态，覆盖率，换液时间等”
   “病毒滴度测定的时候，你只需在48小时之后看才能看到啊，另外应该在高倍镜下仔细观察，荧光产生的不是那么明显的；若要是这样还是看不到你可以在72小时的时候再观察一下；还是没有的话，说明病毒没有包装出来，找找原因看，看看包装细胞以及质粒，转染方法以及比例有没有什么问题，有的时候荧光显微镜的汞灯要是用了太久的话不是那么敏感也不是太好看的”3 ^; {, P/ L' ~; _# M5 G3 U# D
   “按理说，时间长一点，所包装出来的病毒量会更多一些，也就是说时间长一点后，荧光亮度会有所增加，但是，如果你的细胞状态不好的话，随着转染时间加长，细胞死亡，荧光会降低。而且一般收毒48h就行，你怎么56h后观察？你是想收72h上清么？如果你想收72h上清，那么，你期间最好不要动细胞（如果你的293FT状态足够好），因为首先293FT贴壁就不是很牢固，你经常动细胞会使细胞脱落，然后在包毒过程中，不断动细胞，影响细胞包毒，所以，建议在48h看一次就行了，然后到72h直接收毒就行了”[/size]  , U5 ^) Q. E7 t4 K, Z
以上是几位战友的热心答疑，其实这些都是让我们这些新手重新关注于实验细节的，像是293细胞的覆盖率，生长状态什么的，换液的时间等，这些问题其实只要你实验室有着一套成熟的protocol和体系，应该问题不大会出现在这里，for example，就病毒收集时间的讨论，我看过的文献和protocol里大多都是48和72小时各收一次。在24小时的时候应该换fresh培养液的，但是具体到每个实验室又有不同的作法。
（2）利用慢病毒载体进行miRNA的超表达，因为这个方向也是我试验涉及的，所以倍加关注，但是由于我们实验室已经有着成熟的体系和miRNA的慢病毒过表达系统，所以我的工作不是优化，二是直接ready-to-wear了，在此不发表意见，献上runsong大侠的神帖 “ 用慢病毒载体pll3.7进行miRNA的超表达的探索”（以miR-34c 为例）”可谓经典之作：  " p$ S. s" I7 u' \& Q" U1 E
      “http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... t-%B2%A1%B6%BE.html”

作者: rexhz 时间: 2012-1-3 21:02

我现在在构建两个基因共同RNAi的慢病毒载体，老板说两个基因相向效果好，就是 u6---》目的基因1---目的基因2《-----U6.不知道各位如何来看

作者: ellapan 时间: 2012-1-4 06:29

这个问题俺确实才疏学浅，静待牛人出身答疑！！

作者: bin 时间: 2012-2-10 15:17

没有涉及过本领域，学习啦

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