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标题: 关于碱性磷酸酶染色的讨论 [打印本页]

作者: treestem 时间: 2012-1-6 09:29 标题: 关于碱性磷酸酶染色的讨论

刚开始做碱性磷酸酶染色，有几个让我困惑的问题，希望有经验的家人多多指教!
目前用的较多的方法是：NBT，但我感觉NBT染出来是蓝色的，而非紫色和红色。哪位知道什么试剂染出来是红的吗？
另外，为什么有的protocol上说要固定30min，有的说要固定30秒，有的是2min，固定的时间影响很大吗？) o# m; Z( q* ^; A8 \: d, D7 i
PBS洗的时间有影响吗？) c, ~' J% w" g: f! U1 _
TBST的作用是什么？有的protocol中就没有TBST？5 X! l' q+ E/ w% l6 w

作者: tjbone 时间: 2012-1-6 10:55

偶氮偶联法（Kaplow法）2 r& \/ K+ r) n( o; w" m1 x
原理5 a( N; _+ W; n. _1 q& |
中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH9.2~9.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。# N0 B4 g1 B" Y( f' I3 n
结果2 a, P  E) X3 ]2 g
坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。- K/ B1 `$ P1 {/ T& {4 x
实验方法
材料：
1. 10%甲醛甲醇固定液0 b# d9 S8 w/ i& ?# {
甲醛    10 ml
甲醇    90 ml" \5 W- t" |$ a1 Y$ u6 f) p, f) {
20C ~80C避光保存。
2. 丙二醇缓冲液6 H4 U) Y3 z+ d  Q- v6 t
(1) 贮备液(0.2 mol/L)
2-氨基-2甲基-1，3-丙二醇          10.5 g
蒸馏水                            加至500 mL
溶解后保存冰箱内。* o* @5 k/ L* W
(2) 应用液(0.05 mol/L，pH 9.75)4 n* G$ K' v% I$ t
0.2 mol/L贮存液                   25 mL4 D) O, I0 q0 D6 ^9 g" _, Z+ K
0.1 mol/L盐酸                      5 mL
蒸馏水                            加至100mL  f* ~- L' G! B0 g
  3. 基质孵育液(pH9.5-9.6)–磷酸萘酚钠20 mg溶于0.05 mol/L丙二醇缓冲液20 mL，再加坚牢紫酱GBC(或重氮坚牢蓝)20 mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。
方法：
  1．固定  新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定注液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30～60s，待干。
  2．显示  把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10～15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。
  3．复染  置苏木素复染液复染5～8min，蒸馏水冲洗1～2min，待干，镜检。

作者: 南宫燚岚 时间: 2012-1-7 09:50

染色后的颜色根据你所用的kit而定，有的kit是蓝色，有的kit是红色或棕色，具体说明在购买kit时都有的

作者: luoziwei 时间: 2012-1-8 12:09

南京建成的ALP染色液就行，紫色的，又便宜，才180多块

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