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标题: 如何控制实验室中的支原体污染 [打印本页]

作者: cbjonathan 时间: 2012-1-27 13:39 标题: 如何控制实验室中的支原体污染

已具有检测的PCR平台% w% t. W* u, S% N k7 K6 X/ X
细胞培养基培养箱都是新的
请问是不是不是层流实验室就做不出来IPS
如果支原体来源于空气那是不是防不胜防

作者: dianying 时间: 2012-1-27 14:35

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造成支原体高污染率的原因为：
   1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
   2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 ( l: W, a5 d3 P2 s. z5 M2 o! U  V
   3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 1 Q- p) l, f8 |1 W8 x8 `4 h
   4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 5 L, _/ g) b3 r: o4 r
   5、研究或操作人员忽略污染问题
; N  u0 ^4 P$ M' j) O
支原体污染了来源：2 k" [0 Y+ o8 o, k9 a$ `  `
   1、已受污染的细胞 . L- Z) d8 X% Q1 P1 N
   2、操作人员的疏失
   3、已受污染的培养基、血清 8 ]" ?' ^, b; C
   4、操作环境不良、实验器具不洁等. |8 D6 T0 m6 Q+ B6 P& {
3 H" e, M+ ]4 N% R
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。5 ]/ G* k2 V0 r' Y- p0 w* i
+ @% s! T) G  C9 k; V  ?! e9 ]
去除支原体污染： 1 o- v% _% u8 ^$ |+ {$ i( t; S
   1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） . [5 {1 e% @4 q4 @( {6 f' _8 R" _
   2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
   3、Anti-sera ' r6 `: Y. L; d( z" t. Q- W  q/ [3 C

预防与控制方面可从以下各点加强注意：

设备方面：
   1、使用已作支原体测试ok之细胞株 . J- k. h0 F6 p& W0 B
   2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 ' C. `# C, P. _  g* Q
   3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 6 D& G4 ~7 ~# R6 {" a* C' V4 t
- u* B( x1 @- Q, n( x0 K
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。0 h5 A7 U3 |( `  _
% m7 ~" e' R% n0 ^4 N
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求7 j7 G& \+ U' s8 P
9 e7 j# w' G* Z! T1 d9 L
有关支原体污染之问题与回答：

1、应如何避免细胞污染？
   细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。2 h2 r- ?8 J7 M1 f! K

2、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？  y, D' T% a3 D
   直接灭菌后丢弃之。
7 D1 ~' @5 I) \4 Z7 n/ |
3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
   不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
) a1 i# w5 v$ E/ `* [% P
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？- X. R8 K2 u4 p& T
   支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。% |  V/ {% F  f! j0 W

5、侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？5 z/ s8 k& }/ P7 f! [& |9 ^0 b! b, V
   直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 9 Z0 w7 c" f- n0 D; H

支原体之检测： . @2 h: D- g2 y( O8 o

直接培养法
4 w% G5 ~0 Q- g7 l2 U' Q" Z
原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。

特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。, Q' \5 Z( Y1 j: [3 a" |3 r% X

缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
( h$ r, y, ~8 {4 t' `, W$ o
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） 5 V% m4 x" ^5 K2 G- x

培养基制备：2 t2 z6 A6 s8 t) v6 Z# l

基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
- p- j! S$ ~8 c2 @3 @
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 ! n* t% E. U  W1 }4 Z3 W. Z. m
3 u! d9 X! o* I0 ^
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
0 G; T8 |* ?: O7 @, B3 k: m
· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 * `- `9 r7 M( g2 [
$ ]4 ]3 n* {2 [; o, v+ X" l" H
步骤：& ~8 F; a; E9 H! ^) r4 F3 p
2 ~/ H4 A; ?. }
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。5 a( J" L/ J# |& w

· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。2 o, y1 b5 C6 a5 R
6 [5 \" o4 j. s' Z
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。2 m3 r) _  R. [" _/ d

结果判读：
, k2 x: ?. `( B
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。) ~0 E* s( P! p
- D" }. J( X% [. B5 O2 X
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。

· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。' e0 e. _2 \/ H& E

作者: cbjonathan 时间: 2012-1-27 14:43

还是想问% v5 T+ Y% Q* f6 U
不是层流实验室普通的实验室可不可以做出IPS

作者: 艾心痕 时间: 2012-1-27 16:34

只要你的超净台或安全柜没问题，操作小心，注意消毒，一般是能克服污染问题的。

作者: bigsnow55 时间: 2012-1-27 20:17

现在处理支原体相对简单了。可以使用InvivoGen公司的Plasmocin试剂（ant-mpp），无论是用来预防支原体污染，还是处理已经有的污染，效果都不错！:)

作者: cbjonathan 时间: 2012-1-27 22:01

回复艾心痕的帖子
T6 t+ N2 a" k# |8 W- L
那么请问
您所说的超净台没问题具体是什么意思？
长时间的紫外消毒可不可以杀灭支原体？* U' J2 E8 f' Y2 k* r' j( Q
谢谢您

作者: eley 时间: 2012-1-28 12:14

彻底克服支原体污染是比较困难的，基本的实验要求还是应该的，比如说，换衣服，风淋等等。
如果实在是没有办法克服，还可以在培养基中添加杀支原体的试剂，我们实验室就是直接把试剂加到血清里面分装，效果还是不错的，希望对你有帮助~~:)
新年快乐~~又要上班了。。。

作者: bsjy210 时间: 2012-1-28 13:49

1，严格按照分区管理的方式，管理各个实验室功能间，试剂准备，标本制备，扩增，和分析4个区严格区分，工作服严谨混用。
2，检查4个分区实验室的实验状态下的压差，压差梯度从大到小是，试剂准备，标本制备，扩增，和分析。物品流向遵循单一流向，跟压差梯度一致。2 d! ~) |) S6 R% ^& S2 U
3，把扩增和制胶，放在生物安全柜里做，' `. w: U9 H$ Q+ r0 p0 C
4，超净工作台只能在标本制备里设置。其余应防止外排生物安全柜。因为超净台虽然下面是层流，但是他是正压，把空气压入超净台外，就有可能把你的实验物品造成的气溶胶扩散到实验室内，造成污染你的下一个实验。生物安全柜是负压，光进风，就是造成气溶胶，也会排往室外。! c0 m$ v( U& v6 G7 r% l

实验室运行建设，如有疑问，可以给我留言。

作者: song58 时间: 2012-1-29 12:55

培养基试剂最好用新鲜现配的，还可以尝试用0.1的滤器滤一下

作者: shashou_com 时间: 2012-1-30 10:15

支原体污染对细胞的影响在前期是很难发现的，一般的显微镜根本观察不出来。, |% s# Q5 P3 Z( `8 D
但支原体对细胞的状态和扩增是有影响的，很有经验的话是可以看出来的。
没有经验的话，一旦发现支原体污染都是晚期啦，所以要注意预防支原体的污染。

作者: cbjonathan 时间: 2012-1-30 14:39

回复 shashou_com 的帖子

那么您觉得空气中的支原体可能带进去吗？
还是说我把台子，箱子清洁干净然后细胞干净耗材培养基干净就肯定没问题了

作者: cbjonathan 时间: 2012-1-30 14:40

回复 song58 的帖子

那用这种孔径滤了之后，营养物质不会有丢失吧

作者: cbjonathan 时间: 2012-1-30 14:41

回复艾心痕的帖子& u4 Z3 g* ?$ u; n7 R3 T8 `

那请问如果前一个人的细胞是污染的他在台子里操作
然后我消了一下紫外，再开始，会不会被污染呀

作者: cbjonathan 时间: 2012-1-30 14:43

回复 eley 的帖子

那请问支原体污染传染的话+ _$ T4 B! U8 _/ V6 Y4 M" J- M( i
是不是说培养箱里有污染的细胞就会互相传染$ J2 p0 p; j- r. Q; M$ P
台子里的空气也有可能传染呀1 \. p2 M0 z/ t0 H
谢谢

作者: shashou_com 时间: 2012-1-30 17:07

回复 cbjonathan 的帖子

前一个人的细胞污染，要看是什么污染。6 w: d* n) r0 C& Y# q
是空气污染，还是操作带进去的细菌污染，或者
超净台本身受到污染。

作者: shashou_com 时间: 2012-1-30 17:12

回复 cbjonathan 的帖子
2 q! X$ d" R3 |! O# ] L
污染没有绝对的保证不污染，我从事很久了也不敢保证我5 V7 Z+ W$ x# O% H
做的细胞不受污染。有许多污染不是受人多控制的，比如说
器材污染。经验和操作技能只能是降低污染以及快速找出- j2 _4 j7 ]' p# v# _# ?5 r, [
污染源。预防污染条件允许的话，使用级数较高的实验室。7 ?- e. D% F& m' k2 k
无法改变环境，只能从自己的技术上下手啦。

作者: song58 时间: 2012-1-31 11:46

回复 cbjonathan 的帖子& H! r' V2 w7 s/ w+ r
- }# l* g# o! w9 M: F
不会啊，过滤掉的是不溶的东西嘛

作者: cbjonathan 时间: 2012-2-1 10:30

回复 song58 的帖子
/ l; H" k1 F! T5 ~" N- U& k
那请问您实验室有没有遇到过1 G+ U5 D( i$ T! L. }! C
支原体污染后iPS就出不来的现象?, y: o$ Z6 F3 R
具体是怎么样个现象呢？一个克隆都出不来吗？' o$ G1 ?/ s% R' m2 y" q2 n

作者: song58 时间: 2012-2-1 10:47

回复 cbjonathan 的帖子7 j# g% P) K6 ^/ h4 N1 H- @

我没经历过做iPS的过程中支原体污染的情况。* P) w5 W6 N5 W5 l, Z. |
根据实验中的现象和经验：正常培养的iPS或者ES细胞支原体污染后细胞状态就会变的莫名其妙的差，生长缓慢。所以我觉得如果做iPS时出现支原体污染的情况就应该是凶多吉少了

作者: cbjonathan 时间: 2012-2-1 14:07

回复 song58 的帖子
9 n% W L( F: M9 ?% m, t
是的非常的恐怖$ i' Q- u- H3 M/ F& Q$ I
广州的健康所就因为支原体污染导致半年IPS瘫痪
但是我一直不知道具体能严重到什么程度
我在换实验室前（原来层流）很顺* G$ ?* o: ^0 j( H8 ~
换了环境后总是避免不了污染所以总是克隆传不下去貌似只要实验室还有人手上有污染的细胞就会继续传染
0 D/ V0 f. f* M
不知仁兄是否是层流的实验室还是普通的

作者: song58 时间: 2012-2-2 10:44

回复 cbjonathan 的帖子
; D. H" e, Y- q5 [! G0 T& o. \
我们应该是层流的。/ d1 d* W V* ~" R3 R8 W; Z
支原体确实挺讨厌的，一般还看不出来，但是危害却是不小。 ?+ h; N- d) A* z& Z/ b2 [
兄弟可要多加小心了啊，你看用不用先检测一下靶细胞啥的是不是已经被支原体污染了

作者: cbjonathan 时间: 2012-2-3 19:31

回复 song58 的帖子4 s7 _: ~+ f1 t3 \) }: J6 w

是的谢谢
我现在只能污染的丢掉然后复苏出来一个个测了8 X X. M# } A8 r
貌似只有这一个方法了呵呵

作者: LWL7M7 时间: 2015-3-9 14:28

回复 bigsnow55 的帖子

你好，我们买了这个试剂，但是里面有小结晶，化不开。请问有什么方法可以化开吗？说明书上说涡旋，结果也化不开

作者: 细胞海洋 时间: 2015-3-10 08:45

回复 LWL7M7 的帖子* U/ h' Q# E) I
' _7 o8 l' T0 k0 P6 N$ D
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作者: 维维睡啦 时间: 2015-3-10 09:26

如果实验室是符合标准、生物安全柜也是达标的话，一般由于气体交换造成支原体污染的几率较小，人为原因和器械、试剂造成污染的几率较大，所以要控制污染要从这几个方面入手。人员要穿洁净服，戴口罩，口罩要符合标准，风淋，操作时要符合要求，器械定期灭菌，自配试剂要做相关检测后再使用，购买试剂要求有相应的检测报告，做好这几点问题就不大了。

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