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标题: 流式造血干细胞计数 求助 [打印本页]

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作者: zark_00    时间: 2012-2-9 10:08     标题: 流式造血干细胞计数 求助

- Q! N5 ~. N* ?( _" b5 R: @6 L  w
这是未经动员的外周血 CD34+计数的结果，没有成群的CD34+细胞，所以我很疑惑做得对不对，P2门 里没有成群的，P4,P7门里也没有....
1 R! h- u5 j% }0 v$ e外周血EDTA 抗凝，室温放置，1小时内处理检测，采血后用全血自动计数仪计数WBC，均为1*E6/100ul左右，不稀释，按20ul PE CD34 和20ul FITC CD45的量配染色液染色，100ul全血+40ul染色混合液，室温避光30分钟孵育。BD 红细胞裂解液1:9比例稀释，2ml1*裂解液避光室温裂解十分钟，不洗，直接加荧光微球，混匀上机。
$ A% q$ {* I5 z3 Z& R% ?; P% Q2 y! h请问有做过的道友么，急切的盼望斧正啊~~

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作者: linxiao    时间: 2012-2-9 10:17

没有看到图片呀？

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作者: zark_00    时间: 2012-2-9 12:33

3 n% U- _, j% ]8 {3 J" E7 j

  O8 j( |/ a1 b- t( J

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作者: zark_00    时间: 2012-2-9 12:34

试了几次发图，怎么都不行啊，怎么发图啊

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-2-10 01:34


1 R, h# b* ?7 W( w* G- P/ x+ K1 d( p; E* ^9 x( Q
回复 zark_00 的帖子6 ?. r' c, _% |6 a
$ P. B4 P7 E# T: ]" E7 v
回复 高级模式 附件上传 单个图片不要大于1000kb( K5 Y( H- f/ R" q, W$ i
* W! }& s4 `8 v: b
我先帮你处理了

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作者: zark_00    时间: 2012-2-10 23:21

细胞海洋 发表于 2012-2-10 01:34
& F! @0 d- s( Q3 X5 r8 l回复 zark_00 的帖子3 ?9 i: ?* s6 x& F5 }, L
1 h/ s5 R; T/ j1 n6 ?- b# _# L- b
回复 高级模式 附件上传 单个图片不要大于1000kb

% v) s0 c) K2 l$ c7 ^( \7 ?  W 谢谢，我图片和问题都在上面几楼了，请问各位有做过的么，用未经动员外周血，不是用骨髓，也不是用脐带血，能做出可重复性的结果么（CD34+群体明显）。

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作者: cell1314    时间: 2012-2-14 17:57

操作步骤没什么问题。正常人PB未经动员的CD34+细胞比例本身很少，大概＜0.5%。就图形来看，以CD45/CD34为图，CD34+细胞主要在CD45弱阳的位置上，即荧光强度10的3次方到10的4次方之间的位置，可以绘图来看看。, _$ y6 r/ ^& ]7 d  ?
有点疑问，SSC/CD45图上看，怎么会有两团疑似中性粒细胞群？你的样本是外周血样本吗？

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作者: zark_00    时间: 2012-2-19 23:57

cell1314 发表于 2012-2-14 17:57
0 t* P, d& B* m- G# H操作步骤没什么问题。正常人PB未经动员的CD34+细胞比例本身很少，大概＜0.5%。就图形来看，以CD45/CD34为图 ...

* _. w" i1 U4 W; i0 J) O$ W
对，我用的是外周血。。。而且是食蟹猴的（Cynlmogus），用的是BD官网上找的PE CD34, 其说明书明确说可以跟食蟹猴，恒河猴，人源CD34结合，结果做了很多次，都没有明显的成团的阳性群（数量可以大或小，但是一定要成团聚集啊），看文献书籍还有论坛上战友发的人的图，比例再少，也有很清晰的独立的CD34+群体。我的CD45+事件都收集到50W个，总事件都收集到200W个左右了，应该说不是事件数目太少所以不明显的，很郁闷啊。, t; o; |( `/ Y1 Q$ D5 b) K: y
我这相反人血难弄，好容易让同事扎我，指尖采血，用的抗体又不是现在这个，是BD官网上找的明确是用于人源CD34和CD45，结果还是不行（因为现在用的抗体到的比人用抗体晚，所以现在也没试过，同事扎我又怕担责任。。。）

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作者: nek314    时间: 2012-2-22 12:18

也可能是克隆的问题，或者品牌的问题，你可以先尝试换换克隆

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作者: nek314    时间: 2012-2-23 10:26

你把ssc/cd45的门调整到10^3右侧，我感觉你的图下面的红细胞是不是多了点啊，这样可以把比例提高一点

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作者: 笨笨的图图    时间: 2012-4-25 14:15

你的操作过程和分析方法都没有问题，你先做一个百分比的检测，不混微球，只标抗体，做一个空白，一个同型对照，然后把结果传上来再看，我怀疑是绝对计数微球的问题~

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作者: wagumaxida    时间: 2012-5-4 00:20

EDTA中的离子会不会有影响 还好我们这边有个血库  人血不麻烦

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作者: 笨笨的图图    时间: 2012-6-20 14:40

从直方图看，你的CD34是有表达的，你的散点图圈门有很多问题，方便的话，把原始数据传上来，我们大家共同分析一下，看看~

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