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标题: Western Blotting [打印本页]

作者: 新疆八钢 时间: 2012-2-19 11:11 标题: Western Blotting

各位同道，最近在做Western Blotting，在电泳过程中，连续两天出现蛋白样本在浓缩胶中没有被压缩，就开始电泳，导致蛋白条带扩散影响下一步结果的现象。所用的试剂加的正确，过程也完全按正规程序加的，这种情况以前未遇到过，有谁知道为什么？是不是天气太冷，导致胶凝固慢所致。现在广州温度15摄氏度左右

作者: bioaizhiying 时间: 2012-2-19 13:03

我一般配5%浓缩胶，1.5cm长，足够浓缩样品了。若有问题说明是试剂出现了问题。APS容易失效，不要反复冻融。

作者: mirrida 时间: 2012-2-19 14:58

肯定不是温度低的原因，我们冬天都还做WB。是不是上层胶的密度太大了，大小分子蛋白已经被分开，或者是下层胶漏，导致上层胶太宽，还有就是可能不是上层的原因，下层胶凝之前没混匀也会出现带扩散。WB一次没做出来很正常。

作者: zhanglei1414 时间: 2012-2-28 20:25

1，浓缩胶太长，2，浓缩胶浓度大大，3，跑浓缩胶的电压太小

作者: LQAI2012 时间: 2012-2-28 23:00

建议可以检查一下，用于浓缩胶配制的Tris hcl的PH值是否还在6.8附近，蛋白在浓缩胶中的压缩与这个PH关系很大
然后，跑浓缩胶的的电压和时间是否合适？2 u7 n' t+ O0 _9 c. A( F5 s$ s
再有，是否在合适的时候，将电压改为分离胶的电压？

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 11:25

回复新疆八钢的帖子! l) A: J$ `6 \# H6 R
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还是浓缩胶的问题，跟温度等没有关系。仔细看看浓缩胶用到的试剂是否有问题，最好全部重新换掉！！

作者: sallyshaomy 时间: 2012-3-5 11:29

我觉得是你的loading buffer有问题，蛋白没有被完全沉淀

作者: holywater 时间: 2012-3-5 21:07

缓冲液PH不对，蛋白上样浓度太高，蛋白盐离子浓度不对

作者: 新疆八钢 时间: 2012-3-6 10:24

回复 LQAI2012 的帖子

谢谢各位同道：* w; F& U3 e9 z" s
是Tris Hcl的问题，放置太久，PH值发生变化，已经纠正。
建议各位同道在配置Tris Hcl的时候，配置合适的体积，长时间放置容易PH值改变。

作者: LQAI2012 时间: 2012-3-7 21:47

回复新疆八钢的帖子) i5 b+ J0 X: y7 y( D$ H$ x9 x7 d
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嘿嘿问题找到了就好啦~

作者: redmaple 时间: 2012-3-7 22:16

你用多大浓度的胶？你的上样量多大，温度不会有问题。

作者: redmaple 时间: 2012-3-7 22:17

我们用的浓缩胶浓度时4.5%，从来没有出现上述问题。

作者: lingchen04 时间: 2012-3-11 21:19

看一下western的浓缩的原理就应该明白pH值对浓缩起重要作用，类似问题就应该首先检查一下所用的试剂pH是否正确。

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