干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: qRT-PCR结果分析 [打印本页]

作者: safflower 时间: 2012-2-23 08:44 标题: qRT-PCR结果分析

最近在做realtime PCR，结果分析显示目的基因表达下调，溶解曲线等参数都挺好的。再将PCR产物拿去跑电泳，条带显示相反结果，非常明显。很纠结，不知该相信哪个？为什么二者不一致？7 y, X: b+ F/ x
7 }7 a: N# c8 {! e
请高手指点。多谢！

作者: 小松鼠s 时间: 2012-2-23 10:13

纠结啊

作者: jessewill 时间: 2012-2-23 10:24

相信QPCR的结果吧，DNA电泳那么粗放，再确认一下吧

作者: sj03572001 时间: 2012-2-23 11:11

Q-pcr结果重复性不好，不稳定，这也可算是Q-PCR的一个缺点吧，我去年做了近1年的Q-PCR，同样的实验条件，重复好几次，每次的结果都不一样，结果差距很大，搞的人很郁闷，不知道该以那次结果为准

作者: huangcong1988 时间: 2012-2-23 11:30

对，绝对不能相信跑胶的结果，定量结果还是更准确一些

作者: huangcong1988 时间: 2012-2-23 11:33

回复 sj03572001 的帖子! d! y' k4 }" z u9 v6 R! q

是啊，我做了好多次了，每次结果都不一样（我做的是绝对定量），虽然不同浓度Ct值总体趋势一样，但是同一浓度Ct值差别很大（同样的体系，同样的条件），做几次几次结果不一样，很纠结，他们说是加样误差什么的，我也不确定

作者: zdgrp 时间: 2012-2-23 13:04

我去年也做了很多RT-PCR，不同次的重复结果还是很consistent的，是不是机器的原因啊，其他人做也差很大吗？

作者: safflower 时间: 2012-2-23 13:46

对啊，今天做的结果跟昨天做的结果也不一样，Ct值均在35以下，溶解曲线也挺好，为什么变化趋势不一致？该怎么改进呢？

作者: 细胞海洋 时间: 2012-2-24 01:33

回复 safflower 的帖子- X8 Z! B! L7 i# {% ^

询问谁请点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容这样对方才可以看到

作者: safflower 时间: 2012-2-24 10:35

回复 huangcong1988 的帖子
( O% f) H9 R6 E$ ?9 ?
谢谢！荧光定量PCR作为目前最先进的检测基因转录水平的表达情况，确实应该是较普通PCR准确一些，但问题是如何保证荧光定量PCR结果的稳定性，操作的可重复性？

作者: safflower 时间: 2012-2-24 10:36

回复细胞海洋的帖子
6 v) w" K7 `/ i9 H8 S
多谢提醒！

作者: huangcong1988 时间: 2012-2-24 11:08

回复 safflower 的帖子
: s9 t t# M8 S2 p r# r
稳定性？其实随机误差肯定是有的，只要总体趋势一致的话，有小的误差是可以接受的，尽量加样的时候仔细一点，混匀充分一点，然后多做重复，减小误差

作者: lingchen04 时间: 2012-2-25 13:14

本人也做过不少qPCR，个人觉得，上样误差对结果会有一定的影响

作者: holywater 时间: 2012-2-28 10:17

我两个同样加样孔ct值都差距在+/-0.05以内，楼上的那些现象根本不存在的7 i) s$ ~, }9 u8 z$ Q
" B$ E$ Q' M- l% S1 E
原因有好多： 1.请确保每次CDNA量都一致，样品间一致，每次实验一致' g# Z5 E% z9 w2 D" P9 W9 W
            2，请把MIX吸出并暖到常温，或者把枪头冷到0度，保持温度一致; p1 u/ N, r5 w; B& {* R% j
            3，请自己设计引物，不要轻信文献的引物. }0 n6 ?0 A6 c
            4，也是最重要的，你们没加roxII,----至于ROXII是什么，怎么，还要我挨个告诉你不成，自己去看说明书# q! m. o, t- D3 w# |

         我这帖子要求至少20威望

; d8 v% Z; {- I5 t! n7 z4 P1 I& V0 {

作者: 细胞海洋 时间: 2012-2-28 10:42

回复 holywater 的帖子: \# b- p1 y1 Z# s# q
3 ~" N7 j/ f: k$ W" s% D# I1 F7 M

不带这样的
- y$ v9 j! c! d: S
多参与几次讨论不就升上去了嘛

作者: holywater 时间: 2012-2-28 10:48

回复细胞海洋的帖子

哈哈，抱歉。讨论也分数量和质量的嘛) e4 M& q B" E H: g9 {; y5 u

好多人误差非常大，就是因为没仔细看说明书，或者某些小厂家为了节约成本' v$ ], X3 ~, }: _# S
$ P! L$ a, `0 H9 ?! M- _1 C
根本没有给你ROXII,ROX校正试剂

这是好多人感觉误差大的根本问题，加了ROXII后曲线整整齐齐的。5 F' h ]: z# i5 n0 A ~

作者: holywater 时间: 2012-2-28 10:51

以前没加ROXII时候做六个一模一样的孔，误差甚至到+/- 0.5 CT
* o& q/ s z5 x3 K
加了之后误差只有 +/- 0.05

作者: safflower 时间: 2012-2-29 09:17

回复 holywater 的帖子6 V5 M. h- c0 p

谢谢！
我们就根本没有ROX校正试剂。看来以后要找试剂商要了。

作者: sj03572001 时间: 2012-2-29 10:48

商业的Q-pcr Mix试剂一般都分为含ROX和不含ROX的，可以根据需要选择MIX，3个复孔的平行重复一般CT值差异很小，但是同样的模板同样的条件再重复几次的话，往往结果差异就比较大了，所以不能只做一次，根据3个复孔的结果计算标准误，这样的结果是不可信的！

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 11:08

回复 safflower 的帖子

我建议你还是重复实验吧。如果还不行就重新抽提RNA

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 11:16

回复 safflower 的帖子, J P( O! g! F. k8 q# t

首先需要realtime的实验重复。如果还是不行的话，你可以重新抽提RNA，反转录。

作者: lvmaoshiwo 时间: 2012-5-6 14:38

回复 sj03572001 的帖子

定量PCR确实纠结，我做mIRNA的定量重复性不高，一会上调一会下调，肿么办啊~！

作者: frankieisme 时间: 2012-5-7 22:42

q-PCR的结果肯定比普通PCR的结果靠谱,重现性也要好.你的问题可能是操作or机器的问题.溶解曲线好不好只能说明你的产物的特异性,具体量的差异还得看Ct值.你确定做的是绝对定量?一般实验室的qPCR都做不到决定定量,首先是需要Taqman探针,再者需要构建质粒,根据质粒的copy数绝对定量.

作者: safflower 时间: 2012-5-8 20:05

谢谢！

作者: sdjjfangfang 时间: 2012-5-8 21:46

回复 safflower 的帖子

对于Real Time PCR，你要确定你的对比基因的GAPDH差异不是很大，要不然GAPDH差异过大，会造成分析数据的不准确。7 U0 C8 @$ W. |
对于单纯的电泳，首先要看低循环数下GAPDH是否一致，如果循环数过多，会掩盖GAPDH之间的差异。其次要看你的目的条带的循环数，如果循环数过多也会掩盖真实的基因表达情况。6 d2 U* F h8 A( D3 }; i: Q8 u: x7 _
一般Real Time PCR的循环数都较多，如果是用Real Time PCR的产物进行电泳的话，结果一般会一样。但是一般不建议用该产物进行电泳，因为同普通的电泳相比，程序是不一样的。而且Real Time PCR的分析结果显示的是初始细胞中基因RNA的表达情况，而电泳结果则显示的是体外循环之后的结果。

作者: safflower 时间: 2012-5-9 08:58

OK，thank you！

作者: 希望之光 时间: 2012-5-9 09:10

哎!一定要注意个人操作！建议你去看看关于如何做好Qpcr的相关资料，要尽可能的降低主观因素带来的影响！降低由试管效应带来的误差。

作者: 刘艳85 时间: 2012-5-9 13:25

加样的过程，注意些加样的细节吧，毕竟每一种的加样量很少啊。不知道你们做real time-PCR的终体积是多少啊？还有，建议样本最好放在仪器的正中央。跑电泳时，建议加样量取相同的值，以免有的多，有的少，影响实验结果。

作者: 2006dulifang 时间: 2012-5-16 22:54

回复 frankieisme 的帖子) K. B/ H2 H- Z- p, L

根据质粒作为标准合适吗？质粒的扩增效率比较高，结果不见得可行。我试过用基因组作标准和质粒作标准，从结果看用基因组比较可靠。

作者: ophden 时间: 2012-5-17 15:41

多做几次吧，反正做一次也说明不了问题

作者: frankieisme 时间: 2012-5-18 04:50

回复 huangcong1988 的帖子! f1 v5 C9 \5 G O9 G. |( N5 @

每次不一样是可以理解的,只要deltaCt值是恒定的旧可以,因为你每次做的时候阈值定义不一定是一样的,最终mRNA的相对量也是根据deltaCt值来确定的.

作者: frankieisme 时间: 2012-5-18 04:51

回复 zdgrp 的帖子& \' n4 g& n8 j3 H& a

这个变化是可以理解的,但只要deltaCt值相对稳定就可以.RealtimePCR的重复性应该是很高的.

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-18 08:56

回复 frankieisme 的帖子" q2 y2 X4 s8 j1 ^4 V8 G- d
' l. O2 G2 u$ m" p( ]+ @9 a# @
这个delta Ct值是怎么算的？是拿什么减什么？那个Cp值又是怎么回事？可以直接用吗？

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-18 08:57

回复 huangcong1988 的帖子) ^! ~) T8 R% H

如果是绝对定量呢？绝对定量不需要内参，咋办？

作者: 2010liao 时间: 2012-5-19 22:51

定量的结果应该可靠些，

作者: nankou2008 时间: 2012-5-22 10:13

我记得在不同时间做的样品板间还要设几个孔板间的矫正的好像是ROX？! t0 h* f5 B) `( Z: s a: {
qPCR结果是精密的也就决定了在做的时候任何一个小的地方的误差都能导致最终结果的差异
上样时模版量引物量等等都会有影响相信这也是qPCR结果难以重复的重要原因
另外我觉得还是qPCR结果可信点因为这个过程实时记录扩增过程看扩增曲线就能看出
电泳结果只是体外扩增的最后结果相信产物量达到一定阈值的时候就不太看的出差异了# t- H# G( K, G
况且电泳也只是个粗放的检测方式

作者: c05241037 时间: 2012-7-17 09:59

模板浓度确定一样么》？一样的条件下CT值不会有差别才对，我之前做的就很稳定

作者: 张莹莹 时间: 2012-9-7 17:42

回复 huangcong1988 的帖子, G8 x2 B2 u1 O9 @) u- z- X
# A& q8 }5 A+ Y, e$ B
您好，看到你的回复说做的Qrt-pcr用的绝对定量方法，我老师也让我用这种方法，但是具体的还不太清楚，就是如何才能绝对定量呢？

作者: huangcong1988 时间: 2012-9-8 10:40

回复张莹莹的帖子

定量基因的拷贝数

作者: 2006dulifang 时间: 2012-10-23 16:04

回复 safflower 的帖子
- q f; I- _3 G3 w- P: T6 H
看到这个帖子有点晚了。但可以参考我的一点点经验：以质粒为标准时，要看你的样品。如果样品是片段，质粒为标准测的相对比较准。但如果你的样本是病毒，那么测的就会偏低。我最开始用质粒做标准，结果我的样本低于1000左右就测不到了。

作者: mansnoopy 时间: 2012-10-26 10:49

如果你的realtime没有问题肯定是相信定量的结果。。。跑胶的结果完全不可信

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)