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标题: 慢病毒包装质粒能否共用？ [打印本页]

作者: 刘森泉 时间: 2012-2-28 09:33 标题: 慢病毒包装质粒能否共用？

向各位请教：慢病毒包装质粒是否能共用？我之前用公司买的慢病毒包装体系里面带的包装质粒包（pCMV-VSVG和8.91）慢病毒，不成功，但是我用了师姐的那三个包装质粒（PL1/2和VSVG）试了下，竟然包出来了。由于不是做分子这方面的不是很懂，想问下这到底取决于什么，只需要HIV病毒的几个部件齐全就可以包慢病毒吗？那到底怎么看呢？谢谢！

作者: xiongjiedeng 时间: 2012-2-28 09:57

  你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下
磷酸钙转染制备慢病毒
9 p0 u4 F  h3 a2 D' J* M1、试剂配制% h/ P, G/ A# M5 n1 `5 I
1.1  2×HBS（500ml体系）:8 x! x3 A2 \* x& V
样品浓度（mM／L）质量(g)
NaCl 280mM 8.18g  A+ q7 P- z3 o% U% j9 w
KCl 10mM 0.375g5 E* h  x$ ^9 k9 P; E( Q
Na2HPO4    1.5mM 0.1g
glucose 12mM 1.19g
HEPES    50mM 5.95g
配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌# N2 }- x1 j; h7 Y1 N; A1 m
1.2  2M CaCl2 二水氯化钙 58.8g  加ddH2O 至200ml' O+ x5 W$ m' P
2、转染步骤
（1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染
（2）  将下列3种组分混匀
试剂体质或质量
灭菌超纯水H2O 600ul
Plasmid（质粒）
（共270ul） cDNA（目的质粒）    12ug2 G& w* f  _4 G  V4 [6 ]2 @
delta 8.91（包装） 9ug! W% d: q; l" F* d
Pvsvg（保证） 6ug
2M CaCl2 132ul! f$ `  t0 [! f5 v, p$ v
（3）加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可7 m/ g' D, u# ^
（4） 48小时和96小时分别收集上清即可

作者: songyang1987 时间: 2012-2-28 10:17

长知识啊

作者: 164ly 时间: 2012-2-29 09:09

同问，可否共用？

作者: 刘森泉 时间: 2012-2-29 10:42

xiongjiedeng，您好，太谢谢你了，你也用过delta 8.91和pvsvg包过慢病毒。我对这两个质粒分别酶切跑胶鉴定过，没有问题，但是用感受态做大抽时经常提不出来，不知道何缘故，所以我怀疑了质粒的问题。我也用磷酸钙转染制备慢病毒，293T细胞，我相信包病毒过程没有问题，因为我的对照证明包装成功的。请问你有这两个包装质粒的详细图谱吗？校对下。还有，你地点在哪？可以问你要点包装质粒或者菌吗？谢谢！

作者: xiongjiedeng 时间: 2012-3-1 15:19

回复刘森泉的帖子% r1 { b5 O$ Y: I& u

我们实验室用量比较大，包装质粒都是自己大提出来的，我在长沙，你呢？

作者: 刘森泉 时间: 2012-3-1 17:23

谢谢！我在杭州，方便给我一点吗？

作者: Sushi_Tuang 时间: 2013-10-8 09:45

xiongjiedeng 发表于 2012-2-28 09:57
) ^% R4 s- W) `$ G* S% L你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质 ...

想请教一下。请问D8.91和VSVG用以包装质粒时。对表达质粒有要求吗？我用的是pCDH-CMV-EF1-copGFP，请问也可以用这个包装系统包出病毒么？期待您的回复。谢谢

作者: 细胞海洋 时间: 2013-10-9 11:19

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作者: chenhuachen 时间: 2013-12-6 17:54

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！
人的或者大鼠的野生型p53都可以。

作者: 孤野知—少帅 时间: 2015-6-16 16:04

回复 xiongjiedeng 的帖子! S+ c! T b$ G. p2 q

请教：我们实验室用pVSVG+delta8.91包装慢病毒是直接三质粒共转，没有用磷酸钙哎，HBS和Cacl2我们都没有用，也能包出来，这两者有什么区别吗？

作者: 细胞海洋 时间: 2015-6-16 16:33

回复孤野知—少帅的帖子" ?( w2 I, j. D% j8 ~/ V& M* k$ U

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作者: 孤野知—少帅 时间: 2015-6-17 08:25

回复细胞海洋的帖子, Y, ~, o# T8 A$ a
k9 a+ l0 C/ Z. K0 z

我是想请教 xiongjiedeng ，所以重新发帖他不一定看得到

作者: yuanyecat 时间: 2015-7-2 14:40

可以共用的，这个慢病毒都是类似的

作者: l_hu 时间: 2015-7-4 09:27

本帖最后由 l_hu 于 2015-7-4 09:28 编辑
* N1 P3 z0 h5 m: a# O1 z$ A
慢病毒主要由包膜（envelop）、蛋白质膜（capsid）以及遗传物质组成。慢病毒感染细胞时，会将其内部的基因注入细胞内，并由于其基因组内的LTR序列，其基因可以嵌入宿主基因组中而稳定表达。利用这一原理，人们开发了慢病毒质粒系统。病毒包装系统主要有几个质粒组成，包括构成包膜的VSVG，病毒结构蛋白gag/pol，rev等等。8 r: @9 t. ^0 H L
慢病毒包装系统一般由包膜质粒和包装质粒构成。包膜质粒大同小异，都编码VSVG，根据包装质粒的不同，可分为3代：
第一代包装质粒由含有所有的调节和辅助基因。如gag/pol, tat, rev, vif, vpr, vpu, nef等。因为其安全性较低，目前已被淘汰；
第二代包装质粒就是在第一代的基础上去掉了所有不相关的调节基因，仅含有gag/pol, tat, rev。大大提高了安全性，而且不影响感染效率和病毒滴度，是目前最为常用的慢病毒包装系统；如pCMV delta 8.91；; Z4 \! Q# q7 \; V% s
第三代包装质粒在第二代的基础上基因了进一步改进，用强启动子直接表达rev，无需tat基因调节，将第二代的一个包装质粒分为两个。因此，第三代包装系统有仅含有慢病毒9个基因中的3个，相较于第二代的4个更加安全。这也是楼主用的另一个包装系统。但是由于包装病毒需要同时转染4个质粒（3个包装质粒，1个基因），效率可能有所降低。

作者: l_hu 时间: 2015-7-4 09:34

另外，解释一下慢病毒和逆转录病毒的不同。慢病毒是逆转录病毒的一个亚类。主要的不同就是慢病毒可以感染几乎所有的活细胞，不论细胞是否处于增殖分裂期，而逆转录病毒仅能感染处于增殖分裂期的细胞。
慢病毒和逆转录病毒包装都需要gag/pol和包膜基因等，但由于慢病毒的这些基因和逆转录病毒的这些基因编码的蛋白构象不一样，两套包装系统是不可以混用的。

作者: l_hu 时间: 2015-7-4 09:37

最后提供一篇参考文献，详细描述了慢病毒质粒系统。感兴趣的同好可以阅读参考。

附件: [慢病毒系统综述] Use of HIV as a gene transfer vector.pdf (2015-7-4 09:37, 1.74 MB) / 下载次数 24
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NzA0Njl8NGUzN2RjMzd8MTc2NjE1NDgyNHww

作者: lm1982 时间: 2015-10-20 10:52

回复 xiongjiedeng 的帖子# Z" I: m5 E& M9 F k
: }: }7 @1 l, c, V8 a. b2 U
xiongjiedeng，您好，谢谢您提供的详细步骤，想请教一下HBS和2M Cacl2的灭菌方法，高压还是过滤呢，谢谢

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