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标题: 质粒提取 [打印本页]

作者: wangwang1987 时间: 2012-2-28 20:37 标题: 质粒提取

上个星期和这个星期做了同样的质粒提取
然后结果plasmid 的结果，nanodrop 测出来是 4.7和1.17 然后A260/A280是1.55和1.7。* E- }6 V) I. |( [0 L/ ^
知道其中肯定是哪一步出了问题，但是具体是哪里出了问题，真的不知道呢。
补充说明，在提取结果为4.7的那一次的时候，同一批次的样品结果很正常，非常好。

作者: LQAI2012 时间: 2012-2-28 22:47

额你这4.7是什么参数值啊……？% A. p, ]. ]) t9 s' R& T; f( I
质粒的话A260/A280的值，1.55和1.7这两个都有点低诶，应该高于1.8较好

作者: wangwang1987 时间: 2012-2-29 01:20

4.7是浓度 4.7ng/L

作者: LQAI2012 时间: 2012-2-29 09:58

回复 wangwang1987 的帖子2 f/ q: O5 X$ G% s2 D& e7 s
; y* f: d* k5 ^- T/ i
4.7ng/L？？+ _( M, s2 g( Z
应该是ng/ul吧？要是这样，质粒提取的浓度相当低了……
这么说你说的问题就是浓度太低？
7 w; _% _! i! J7 g
如果是这样，可能的原因很多诶
首先，用于质粒提取的菌量是否足够？4 t* ~! O6 b! u+ M+ G
然后，溶液二的裂解是否充分？
在最后用于溶解质粒的溶液（TE或水）的PH好像也很有关系（7.0-8.5），还有若是在50℃预热溶液会有利于提高溶解效率' v. T6 I" W- q# ?
( Q8 o4 m6 g: s9 m
希望对你有帮助

作者: mirrida 时间: 2012-2-29 10:29

  4.7ng/L？？太低了吧，是不是单位弄错了.用试剂盒提取的话，我们提的浓度一般是300ng/ul! % s: C9 R) J( G' r4 n4 x
  260/280小于1.8是蛋白含量高，可能你的细菌收集的太多了，或者是加裂解液后没混匀，影响了裂解。
  加裂解液时要完全混匀，你可以把去蛋白那一步多重复一遍。收集质粒时要把洗脱液滴到管中心，定量的洗脱液可分几步加，多重复几次。

作者: mirrida 时间: 2012-2-29 10:31

其实提质粒时，260/280小于1.8的，1.7左右也能转染，影响不大。

作者: wangwang1987 时间: 2012-2-29 16:30

谢谢各位我的单位没有写错哈~所以我得再看下。想一下，因为同一批次提取的都没有问题诶~

作者: holywater 时间: 2012-3-2 19:41

很正常的，我还有中抽管子啥也没抽出来的时候呢，那叫一个心疼，好贵啊7 d' b0 E1 v. s; U) J
; o$ E; F( l8 v% S- }
有时候抽的漂亮时候，50ml的管子半个小拇指甲那么多DNA，那叫一个高兴
5 G- f, r; ]6 g1 r+ v% |
管子，尤其是国产的，质量不是那么平均的。。。

作者: xiongjiedeng 时间: 2012-3-4 23:29

A260/A280是1.55和1.79，不太理想呀，nanodrop 不一定靠谱，建议做酶切鉴定，如果与质粒图谱不符，就准备重做吧~~质粒提取的出问题主要子啊试剂与操作，操作要谨慎，试剂建议全部用新的吧~~

作者: hany2007 时间: 2012-3-5 00:32

建议：1.重新用接种环划线涂板，挑选单克隆。固体培养基抗生素浓度为：卡那50微克/ml，氨苄为60微克每毫升。
   2.挑取直径大于3mm的菌落，接种于3毫升液体培养基中，抗生素浓度为100微克/ml的。37度，220rpm，摇菌14h。, M( T+ {* ?  y1 B4 t/ G# f
   3.菌液一旦达到所需浓度，建议马上开始提质粒。
   4.洗脱时，建议把洗脱液温度加温到65度。) S. I% ]5 A; a2 T

   关键是挑克隆，摇菌，提质粒连续进行，期间切勿中断。我现在用天根的试剂盒可以从2.25毫升DH5alpha菌液里提取到12微克质粒，浓度为80ng/微升。" `8 c# [0 H+ o1 z
   万一还是不行，建议你重新做转化。

作者: huangcong1988 时间: 2012-3-5 10:02

回复 wangwang1987 的帖子
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浓度太低了吧？您用试剂盒还是常规提取方法？还有试剂盒品牌不同，抽提效果会有很大差别的。! E$ R4 i$ K& d( M
如果您需要的质粒质量要求很高，建议用好一点的试剂盒，另外A260/A2801.55和1.7都偏低，如果不是太严格的要求，1.7还是可以的，但是1.55太低了。1 J9 I: ]/ a3 x5 y" l t
提取结果为4.7那一次，其余样正常，可能是因为您的该质粒拷贝数较低，在扩大培养时它本来就不会有太多复制与增加，所以比较低
如果说是哪一步出了问题，我觉得最有可能出问题的几步是：1.加入solution1的时候，混匀不充分，2.最后溶解质粒使用的水，这个很关键，不同试剂盒里面带的水PH都不同，如果不是特殊情况，千万不要用其它试剂盒里面的水，因为你提的质粒极有可能在该水中溶解极少

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