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标题: pLP1、pLP2、pLP/VSVG包装慢病毒 [打印本页]

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作者: 刘森泉    时间: 2012-2-29 10:47     标题: pLP1、pLP2、pLP/VSVG包装慢病毒

请问有人用过pLP1、pLP2、pLP/VSVG包装慢病毒吗？目的基因和包装质粒的用量分别是多少，包装效果最佳？我用的是磷酸钙法，用293T包的。谢谢！

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作者: sizhengliu    时间: 2012-3-1 16:32

回复 刘森泉 的帖子% C% R; F2 ]9 `9 b9 s

) f; c+ X( W8 s' v/ x2 p试试1：1：1

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作者: ghfvcat    时间: 2012-3-2 12:44

英骏的慢病毒包装系统？- I% p6 Y3 p' e: I# ^
英骏很会做生意，这些质粒都是混在一起卖的，不拆开来卖，也不告诉你比例。一万多的试剂盒，里面质粒混装，只够转20碟细胞的。6 x8 H! U, i% q3 Y8 u# c7 F  M
楼主要是试出来最佳的比例，广告一下，气死英骏，哈哈

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作者: franklinhg    时间: 2012-3-20 01:25

其实要破解英骏的花招 很容易的。 四个质粒都是按照1：1：1：1的比例混合的，而且最关键的是四个质粒都是氨苄抗性的，这个就好办了啊！转化一次，多挑取几个克隆，扩增后提取质粒，配置1.5%-2%的琼脂糖，然后电泳，根据分子量的大小，可以知道那哪个质粒是哪个了，这个也许要多几次，看自己的运气和手法了。 我向别人要了10微升的混合液，然后这样做了，分出来了需要的东西， 给师弟在用了。效果还可以哈

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作者: sj03572001    时间: 2012-3-26 15:43

楼上是怎么确定pLP1、pLP2、pLP/VSVG质粒混合液中的各个质粒的比例是1:1:1的？，很多童鞋说按1：1:1的比例包出的病毒滴度很不理想

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作者: salomemao    时间: 2012-3-26 22:53

我用的是SBI的慢病毒包装系统，感觉病毒包装效率不高，但是现在也找不出什么原因。我也用电泳把混合的3个质粒分离开来了，而且按照不同的比例与买的混合包装质粒的包装效率进行的比较，都不高。有哪位大侠能分享一下提高包装效率的经验呢？现在我有买了浓缩病毒滴度和提高感染效率的试剂，现在还没有到货，到了以后试验一下，如果效果好的话分享给大家

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作者: igdb    时间: 2012-3-28 10:03

这个推荐比例确实是1:1:1的。ADDGENE上应该有卖的吧，国内国外好多实验室也有这套体系。我也用过这套包装过病毒，效果也不是很理想。 个人认为提高转染效率是关键吧。

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作者: ghfvcat    时间: 2012-3-28 10:20

哈哈，实在不确定比例的话，从英骏买个现成的混合物，做一个实时定量看看质粒的比例

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作者: sj03572001    时间: 2012-3-31 11:32

VSVG作为膜蛋白，表达量过高对细胞毒性，回造成细胞死亡，如果按1:1:1的比例应该不是最佳的，nature protocol  有篇pLP1、pLP2、pLP/VSVG系统慢病毒包装的文章，文中的比例约为4:2:1，可能就是考虑到VSVG的毒性，文献如下

附件: 高滴度慢病毒载包装-nature method.pdf (2012-3-31 11:31, 215.46 KB) / 下载次数 380
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDA0NjZ8MTM0OTkwNDN8MTc2NjA2MzQ0M3ww

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作者: hetven    时间: 2012-4-20 15:06

这比值似乎是存在一定争议。有人建议1:1:1:1，但VSVG确实会对细胞状态影响较大。另外一个比较流行的建议是plp1 10.5, plp27, vsvg 10.5，表达载体9.5.# L2 I; p, r2 B
- |$ X: h. x. u& v2 h1 Y
在plos one在篇文章的比例是1.3表达质粒，0.9 lp1，0.3 lp2及0.5 vsvg。这个vsvg比例似乎合适，但显然不符合表达质粒:包装质粒为1:3的规则。另外，这篇文章加Cacl2转染，不知道为什么。

附件: 第二页有慢病毒包装方法.pdf (2012-4-20 15:05, 530.59 KB) / 下载次数 99
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDExOTN8OWViZmQ5MWR8MTc2NjA2MzQ0M3ww

附件: plos one有三质粒参考比例.pdf (2012-4-20 15:06, 303.91 KB) / 下载次数 102
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NDExOTR8OTRmODYwYmF8MTc2NjA2MzQ0M3ww

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作者: hetven    时间: 2012-4-20 19:07

ghfvcat 发表于 2012-3-28 10:20 & t* z8 q' g* o5 I6 S- g
哈哈，实在不确定比例的话，从英骏买个现成的混合物，做一个实时定量看看质粒的比例

, F5 ~/ B/ H% Y9 k确实要知道也不用实时定量这么麻烦，太敏感了还容易放大误差。
9 o* I6 u3 X9 n) p3 H! r$ S- {2 X1 c8 i! t: A& r
如果有现成的混合物，买回来，跑块胶，大概就知道了。

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作者: hetven    时间: 2012-4-21 00:52

sj03572001 发表于 2012-3-31 11:32 : ~& g  \6 c- J5 O( j
VSVG作为膜蛋白，表达量过高对细胞毒性，回造成细胞死亡，如果按1:1:1的比例应该不是最佳的，nature protoc ...

6 V1 r0 r, T% g5 o5 b& ]: g0 K* j+ W这篇文章的质粒用量好大啊。

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作者: hetven    时间: 2012-4-21 00:53

ghfvcat 发表于 2012-3-28 10:20 6 }: F% t+ Q7 J+ U. v  g& T
哈哈，实在不确定比例的话，从英骏买个现成的混合物，做一个实时定量看看质粒的比例

' T  K9 U( @2 V# @
要知道也不用实时定量的，太敏感又缺乏内参，误差的放大无可估计的。
( K6 O) [+ U, x) b' K5 X7 q, I% Y: k# }: m  W; O3 {, V
直接跑个胶就大概知道了，关键是没有这个混合物。

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作者: ghfvcat    时间: 2012-4-24 11:43

回复 hetven 的帖子6 @$ k0 O- Q: E- K
& r# K- x1 g  I2 h, Z) w. A/ E
买一套罢，然后破解了就拿出去卖

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作者: ouyi2738    时间: 2012-4-24 17:42

回复 hetven 的帖子' w; X5 y/ T* _+ M/ f+ Z: s" p0 ?) L

6 Z3 c) ]; R. U* E  M+ }7 `6 S不大了，他那时12X15dish的量 ，我们10X10 用的是 100 100 20 50

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作者: jinyingxue2009    时间: 2012-5-31 23:26

O(∩_∩)O谢谢

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作者: huangcong1988    时间: 2012-6-1 14:18

按比例大约为1:1:1试试，就是说目的基因跟包装载体按5:4试试（5:5:4），你可以试试，膜蛋白毒性很大，多了不好，所以适当降低其比例是可以的

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作者: biosenselot    时间: 2012-6-29 10:19

有谁做个比例优化啊

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-7-1 15:25

回复 biosenselot 的帖子
0 s/ V; v6 l* V2 Y5 j
, D) T& U, V% n5 F8 a& E& b建议你发新帖提问

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作者: cjyifan    时间: 2012-7-9 10:43

正准备用这套病毒！！好东西！

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作者: hhs359853381    时间: 2012-8-13 00:22

回复 sj03572001 的帖子; S  X! z6 D) ?. [& l

2 ~/ C# e) |1 ^/ {+ [9 `4 Y/ z; z这个很有帮助啊，谢谢啊楼主

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作者: hhs359853381    时间: 2012-8-13 14:27

回复 sj03572001 的帖子: `/ c6 _* M% \

+ R( Q: c: l$ H* i好东东

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作者: hhs359853381    时间: 2012-8-13 14:32

回复 hetven 的帖子, ?5 F* H5 K$ ]* W* v9 N7 j- O# V. {
* o' I+ t1 }% b: t, l7 i: y+ w
我们实验室用的也是1:1:1:1，但是每个质粒的量都没有那么多。

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作者: sunyuzhu10    时间: 2012-8-26 15:50

我也在包装，能看到慢病毒，但是滴度不高是四质粒系统，但是用三质粒系统完全没有，哎郁闷QQ 404435995  有兴趣的哥们来交流下

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-8-27 09:20

回复 sunyuzhu10 的帖子
5 c7 f4 ^7 a9 W$ }+ u! H; W' b. R7 ~4 v& Q
有问题请直接发新帖

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作者: code66    时间: 2013-1-11 16:18

谢谢！

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作者: code66    时间: 2013-3-11 08:40

先谢谢了

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作者: jingmishensi    时间: 2013-6-3 16:03

学习下！！！！！！！！！！！！！

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作者: jingmishensi    时间: 2013-6-3 16:04

学习下！！！！！！！！！！！！！

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作者: 翱翔的鱼    时间: 2013-7-21 12:47

具体优化比例是什么啊

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作者: Dancmacabre    时间: 2013-7-23 22:37

这几个比例每个公司都有自己的体系，体系一般固定不变，但这几种质粒在大提时想得到高质量的质粒有些困难，Mage、MN的试剂盒都试过，也不是很理想。每一批次的质粒质量直接影响每一批次慢病毒包装试剂盒的质量，必要的时候根据定量PCR的数据效果，会尝试稍微改变体系，这是一件很费时费力的事。

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作者: 细胞海洋    时间: 2013-7-24 10:09

回复 Dancmacabre 的帖子3 ?# g! Z! a$ }5 @
( k$ n! b9 a. r5 d4 S& T
你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样( x# Z7 p+ Y" c% L: f
  g- R0 }/ ?0 \' {3 m4 g
否则他会看不到
# |0 n$ b# z1 e

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作者: 细胞海洋    时间: 2013-7-24 10:09

回复 翱翔的鱼 的帖子
( A& k6 o3 ^1 J: e/ }
4 V; U0 ]- F+ N% \. `! z: M看31楼

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作者: 天山水    时间: 2013-11-7 13:00

这套系统我也在用，在包pCDH miRNA时，效果很不错，浓缩后滴度可达8次方。* o2 e( A6 E6 H* R, J* v' {
但是包装pLVX时效果则很差，不知道是不是兼容性不够好。# V9 r, v9 L. c' @
我觉得pLP2的量不能太少吧？因为Rev不仅要带入核，还要允许pLP1上gagpol表达，个人觉得5:6:5:4是不是比较合适~

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作者: shermin    时间: 2013-11-19 16:31

回复 sj03572001 的帖子
4 v+ Q5 D0 x: y; p+ d2 P6 |
& r0 J7 D; n* g' I( M一点问题，
* A5 o5 P2 n4 U+ b2 E( `06NP里的质粒质量比例 transfer：pMDL（gagpol）：pRev（rev）：pVSVG= 270:176:68:95
, z9 M2 I4 G2 m! c: W, {
# C$ \4 m* K- k# E/ \如果考虑各质粒的大小改为mol比的话，我算了一下大概是=34:20:16:16
. E9 }) G7 ^3 `* Y: {9 m& l# O也就是说，表达质粒与包装质粒的mol比例为=34：52 约等于 2：30 f7 }' y+ n* M+ ?
; u9 f# N, ~# s- s
我一直困惑所谓的比例是应该按质量还是mol计算。: \5 u5 D% y9 t. w4 W
& u# R% s1 N& W2 c  g9 F
还请高手们解惑，=）拜谢了~

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作者: wangtj100    时间: 2013-11-19 20:43

还有一套包装系统PSPAX2+PMP2G跟这个包装质粒系统有什么差异

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作者: 细胞海洋    时间: 2013-11-20 08:07

回复 shermin 的帖子; i: a3 K/ V* t& ]

9 w6 l) [5 T9 f1 j建议你发新帖提问

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作者: ruthlqttt    时间: 2013-12-7 21:21

1：1：1：1出来的效果不是很好啊

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作者: zje6265610    时间: 2013-12-26 11:28

我也想知道哪种比例效果最佳，求高手指教

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作者: 细胞海洋    时间: 2013-12-30 01:19

回复 zje6265610 的帖子/ w5 U9 [: l! P8 y4 f! y

# }! r# q4 o" W) U; ^建议你发新帖提问

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作者: 懵懂干细胞    时间: 2013-12-30 09:15

这个帖子不错，最近也在包慢病毒，感染肝癌细胞株Huh7，想请教谁包装过比较大的外源片段是多少？ 我包了个4000bp左右的片段，有点表达困难的样子

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作者: harryyuan    时间: 2014-3-7 10:55

真是学习了

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作者: mr88mr88    时间: 2014-3-13 10:37

学习了，好东西

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作者: 450235883    时间: 2014-3-14 13:59

新手求指教，想下载下载不了

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作者: 芋頭    时间: 2014-4-24 16:11

我们用的一直是10:5:6的比例

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作者: 戒不掉你的微笑    时间: 2015-2-5 15:06

谁知道关于pLP1、pLP2、pLP/VSVG转染时要加的量啊!

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作者: yuanyecat    时间: 2015-2-5 15:24

我觉得你可以用life tech的病毒包装试剂盒，好像效果不错。

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作者: chenhu9182    时间: 2015-6-16 09:09

包装病毒，最主要还是细胞状态好才行

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作者: sam1123581321    时间: 2015-6-17 11:54

好东西，我看看先

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作者: chenhu9182    时间: 2015-6-19 08:41

一个10cm大板的使用量：pLP1：pLp2：VSVG：Vector=6.5:3.5:3.5:12

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作者: realjade    时间: 2015-11-13 22:33

参考一下
* `0 ^1 l9 e* H. i! q; Y

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作者: Virus-PRRSV    时间: 2016-2-21 16:46

有谁试出合适的比例了吗？求教啊，最近要包装病毒了

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作者: 洗瓶子的阿虎    时间: 2017-6-21 16:04

:怎么下不了文章

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作者: hautlitang    时间: 2017-7-7 11:06

回复 sj03572001 的帖子
3 `/ I* [: `3 ~: f. h
6 T& c5 C: W& L8 L好好 挺好的

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作者: hautlitang    时间: 2017-7-7 11:07

好啊 这么好的帖子

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作者: HERMIONE    时间: 2017-10-11 14:17

Nature 那个是哪一篇？ ID?

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作者: ts902    时间: 2020-6-1 17:51

回复 sj03572001 的帖子
4 F8 Q# H* \4 ]7 u9 s! i
: ?' Z. R. R$ ]% a# V" h你好，请问能转发一下原文吗？或提供一下原文英文名称，谢谢！

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