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请教大侠们实验设计方面的问题
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作者:
懵懂干细胞
时间:
2012-3-2 17:04
标题:
请教大侠们实验设计方面的问题
1、2009年浙大分子考了一个这样的题目：有一个蛋白X，发现其在血管内皮细胞中与信号转导通路A有密切联系，如何证明在此细胞中与蛋白X相互作用的蛋白。
2 i, ?4 ?- Z* M. b/ h/ ^; t
2、如果某信号对某蛋白有作用，设计一个试验来确定这条信号通路。
+ n7 d2 T$ v- m, o- o* R# I
3、设计一个试验了解整个信号通路的传递过程。
( ?7 H6 c/ |5 X5 f2 B( X' P+ v- a" U
还望大侠指教！！小弟感激不尽
作者:
zzc2211
时间:
2012-3-2 23:37
本帖最后由 zzc2211 于 2012-3-2 23:45 编辑
: i3 u9 r' @% W+ ^$ U! j& o
4 c- @ T9 M+ A* Q0 t7 \/ Y6 w
可能是版主为提升大家的讨论学习气氛发起的吧，同求大侠指点，如版主知道答案，请不吝赐教，共同学习。本人想法如下，前提：蛋白X---可能与---信号通路A。通过免疫共沉淀（或GST-PULLDOWN）得到蛋白复合物，Western blot检测A通路上的标志性蛋白。（或刺激后免疫荧光观测X和A通路标志蛋白的共定位）。如得到阳性结果，则需进一步证明X和标志蛋白的上下游关系。把X knockdown观察标志蛋白的变化和蛋白带来的功能变化，继而还会有Real-time-PCR，报告基因或酵母双杂交。如没有这个前提，更复杂吧。关于第二个问题：A蛋白受B通路影响，C为B通路的刺激因子，D为B通路的阻断因子。分别加入C刺激和D阻断，western bolt 观察A蛋白的变化，对比区别。如果哪位大侠知道答案，请不吝赐教。
作者:
yyshpy
时间:
2012-3-3 11:05
楼上说的有道理，但是做起来可行性还是值得怀疑的，知道蛋白X，首先做生物信息学分析，去发现可能的蛋白，再加上参与信号通路，可以选择通路抑制剂处理，寻找相关信号通路，两者结合，比较容易确定与蛋白X结合的蛋白A了，然后做免疫共沉淀，免疫荧光之类的实验去确定，之后就比较容易了
2 |) ^! \: j& ~0 o1 J- {8 f
个人一点拙见啊
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 01:37
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zzc2211
的帖子
9 [+ j( E1 W) @% v3 `4 U
4 g1 s" K7 b3 ]/ ]& E
2楼的做法有很大漏洞。 1--并不一定是蛋白=蛋白直接相互作用 ，不是直接的怎么PULL
- T; f* j9 D( X8 Z
. v) V" _! G! }* W, C0 _
2=就是能拉下来，western抗体挨个杂吗？
5 d/ F9 r+ q# H' {0 M
! W5 b' n V1 U1 G
3 如果是蛋白直接作用，realtime起什么作用？
4 U9 g, C7 H( `& i& Y, y: ~0 D% n
5 K8 h$ B, \2 v( P7 M
要我是老师，这题目你肯定0分嘛
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 01:39
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yyshpy
的帖子
$ g- ^% V; r- e% m
3 y) Z, J' G1 i; e( U7 C( w
3楼说的有道理，但是有个最大问题，生物信息学经常不准的，否则生物信息学家早就统治世界了。不过思路是好的，至少可以得30分/100分的话
0 s! U8 v) O: G4 s0 d
作者:
hany2007
时间:
2012-3-4 02:40
有一个蛋白X，发现其在血管内皮细胞中与信号转导通路A有密切联系，如何证明在此细胞中与蛋白X相互作用的蛋白。
; b9 Q# D& H# A& B7 @
1.用X蛋白的抗体做免疫共沉淀后，跑sds-page，染色后去打质谱，确定与其相互作用的蛋白。
( E" T& ^2 B+ D* q1 b5 ?
2.打谱结果出来后，再次以flag或myc或ha标签质粒克隆候选基因，再次做CO-IP验证。
b7 R" h+ E; | f8 O! y, K+ w
3.验证出来后，用截断体或点突变确定结合位点。
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 09:17
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hany2007
的帖子
: A' _& f+ D# E- t6 U4 {5 Z
+ T, l" J# X. I% J' q0 }, U
也是同样的问题，如果蛋白不是通过直接作用来影响通路，你实验做死了也没结果嘛。
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 09:18
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hany2007
的帖子
" C* X7 c" Q& a0 l5 e2 [
# a+ _ V. {8 `9 E" k% G
还有个问题，一个蛋白可能影响很多通路呢，你有可能杂出一堆蛋白。
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 09:20
借人气求一美女QQ聊天
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 09:23
本帖最后由 holywater 于 2012-3-4 09:25 编辑
. o+ E; v" P7 o3 Z/ x
# e# Z5 X5 s$ Z7 d0 W1 `+ _+ n7 g
如果蛋白A可以和蛋白B,C,D作用，而D是你要的通路，但是蛋白和B亲和力很高，而B的丰度又很高，D又低的时候，你有可能做出的结果就是蛋白A和B作用。pulldown不是那么严格的东西，它可以用来验证两个蛋白是否作用，但是不能来验证两个蛋白不作用。不知道我说的大家明白不
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 09:32
我再举个例子吧。如果蛋白是通过提高钙水平来影响通路，那么蛋白可能下面牵扯到无数通路。
* k$ R# L* G5 `, }" E, [" w
" H$ | N$ L1 x( v! k" |5 v
上面的回复你们看有几个有用的，能检测出来的？全灭吧，哈哈。除了生物信息学那个可能有些靠谱。
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 09:34
看到作用立刻想到IP和pulldown的，要反思了！
作者:
hany2007
时间:
2012-3-4 10:16
如果不是直接作用，ok，用rna干扰或基因超表达后检测某个信号通路最终产物的变化。不过这就要看你的文献功底了
作者:
yyshpy
时间:
2012-3-4 11:23
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holywater
的帖子
8 T" j5 I) S+ B$ e. x
* x5 u% ~' P8 }$ Y7 j
哥，你在自娱自乐呢吧，否定了一大批，你也谈谈自己的设计方案啊，给大家指点迷津
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 12:36
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yyshpy
的帖子
7 D# R8 i# N- d. i! S3 C# r
v- E# i& [9 a6 K* A
不是自娱自乐的问题。实验设计就是要尽量避免漏洞
& s# A8 M1 A0 p
; F7 ~7 p7 U. f/ R5 }6 k" f, m
针对我那个钙信号的假设通路，
" V# V2 z$ b6 u
/ m+ C9 V' L' o: j/ x* g6 Q
上面那些方法，除了信息学有点靠谱（也不是绝对靠谱），别的都没办法做出结果
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 12:37
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hany2007
的帖子
/ M3 x" v+ P( n1 y' k
5 @0 M/ i2 Z( v {/ X9 l- O3 l
还是老问题，如果他作用于很多通路，专一性不是那么强的话，还是很难。
作者:
hany2007
时间:
2012-3-4 14:31
小的时候，父亲教导我思考数学问题时，常常对我说，就是一条狗也知道直线前进去吃到肉骨头。顾虑良多，原地踏步。
作者:
ligangcw
时间:
2012-3-4 15:52
holywater 提出了不可行的方案，是否将你认为可行的方案讲出来供大家学习？
作者:
ligangcw
时间:
2012-3-4 15:57
蛋白X与信号转导通路A有密切联系，那么蛋白X可能与信号转导通路A相关的蛋白结合，是否可以通过过表达和敲除蛋白X再通过蛋白芯片分析过表达和敲除之后蛋白谱的变化，然后再一一验证和蛋白X相互作用的蛋白
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 21:21
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hany2007
的帖子
& K% ]* Q" k* V/ s2 ?, t8 V
# n. G" s- X- q D6 R2 i
实验设计是在一个地球里有一个肉骨头，直线前进肯定碰不到嘛。
; p/ \0 `0 i9 O+ A) w
. O' ^, b! C& D
顾虑是不必要的，但是实验设计不能有漏洞
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 21:25
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ligangcw
的帖子
" f/ z: o# z1 S+ U
6 W) u4 H# T* z; F) r
蛋白X与信号转导通路A有密切联系，并不意味着蛋白要和A相关的蛋白结合
# R q" x/ x I8 m. e, m
l+ \$ G$ b4 t9 x
比如： X影响了钙信号/CAMP信号 下游通路，而A通路正好是下游之一
, p( m5 \' y7 }0 o/ C! H3 M
或者： X入核--促进A通路相关蛋白转录
2 y. }$ T0 ]9 g3 `2 \4 p3 x: b
# b, }( m. H! j6 t7 t1 l
这两个就不符合你的第二句嘛。
0 t+ H7 W( n& [; l% _6 X
4 R, f" B( ^: Q# [
另外你的第三句，敲除X蛋白然后芯片分析变化----会得出一大堆杂乱的结果
1 F1 @! R$ D. k, B
" o7 w) E! ~" o
也许你要的答案在里面，也许不在里面。另外只对X下游有效
3 x" b% i( k* C- N6 Q4 Y
/ {, j! ^! g, }& f6 d% I* X- z/ h
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 21:28
我不告诉什么方案可行，是两个顾虑：1，我的方案也不一定无漏洞；2，教会徒弟饿死师傅
) I% q y& O3 t
2 ^, n8 R% O6 e, F1 w
我用例外来反驳你们的实验观点已经够够意思了。拜托在你们脱口而出恶意的话之前，好好反思一下自己傻乎乎的观点好吗？
: h% G+ z& ?4 R, {
8 ^/ i8 I+ A/ d
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 21:31
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hany2007
的帖子
4 `- u; A$ Q1 d1 J# t2 _7 u/ ~
- O/ }1 s- H* F* s; [$ X; z
如果你知道X作用于A通路，你的方法也行可行
/ H. ~. e0 G; U/ \0 @# T6 O
; j+ Q7 K- |8 W
如果你不知道，怎么去猜测无数通路的哪个呢，挨个去做？
3 i7 O6 j& ?/ z% U0 R
3 U1 @$ W% I/ e$ Q4 @, `& o4 t
但是如果知道了，还要做什么实验。。论文早被人家发了。。。捡骨头呢。。
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 21:42
抱歉最近身体很不好，连带着脾气也不怎么样，请大家原谅。
8 k: h: p4 K/ A( b! o6 L+ h
: S' @9 x% `6 Y& O7 c& R
这样说吧，楼上有人的回答可以在考试时候对导师投其所好的回答，也可能得个高分
) C; M6 E; J1 U4 O
7 y, W* n# i! G8 A7 c
但是千万别以为搞科研就是这样！那是要不得的。
+ x- w0 F1 A+ x- S( w
4 N$ Z& \; l- v" ?9 w/ {$ `4 s
每次自己提出观点，要绞尽脑汁来反驳，举出反例，来看看自己的方案有没有漏洞。
) s& A2 \7 z- Q' }1 P
7 w3 Q7 ^% r: T. O1 |. w# j
PS：最近养病养的很无聊，求一美女QQ号码聊天。
作者:
zzc2211
时间:
2012-3-4 23:02
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hany2007
的帖子
8 N$ ]2 D# Z. Q3 Z
2 [# p2 a, j5 S/ d" F! @0 P4 {
我的套路和你的是比较一致的
作者:
holywater
时间:
2012-3-4 23:33
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zzc2211
的帖子
9 I# s" d4 G! y5 r1 j/ k; k$ t+ t; Y8 I
& p, y- u* @" q( y: [3 z
难道你们没意思到自己思维的错误吗？天。。。我不说了。
作者:
zzc2211
时间:
2012-3-5 15:16
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holywater
的帖子
. ~) U( P7 T+ Q4 h
0 ^' X C# K( w2 s
能否把你的想法很具体的讲出来，我的水平有限，学习
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