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标题: 关于胰酶消化细胞 [打印本页]

作者: zdgrp 时间: 2012-3-2 21:58 标题: 关于胰酶消化细胞

最近养小鼠ES细胞，每次传代时用0.25%的胰酶消化，胰酶从4°冰箱拿出来后没有37℃预热，在超净台放到室温。感觉有时候消化的太厉害（超过3分钟），有时加培养液终止、吹匀的时候又有些贴壁没消化下来的，请教一下应该如何把握消化的时间？谢谢！

作者: lingminliang 时间: 2012-3-2 22:16

胰酶的消化能力并不是一定的，不同的批次对不同的细胞的消化能力也不同，而且新配置的酶的消化能力较强，随着使用时间的延长，消化能力就降低。

作者: xiongjiedeng 时间: 2012-3-2 23:17

从4℃出来要在37℃预热半个小时，效果会好很多；然后得看你的细胞了，不同的细胞对胰酶的反应不一样，还有细胞的密度也有关系，所以楼主要慢慢摸索，总结经验。我一般是用2ml的胰酶，消化2—3min足够了

作者: safflower 时间: 2012-3-3 08:14

以下几点可能需要注意：" K* d; h; i6 U* W% D: a U5 u- z
1.一定要让胰酶均匀分布在整个培养板/瓶中，可以轻轻晃动使其均匀平铺于整个细胞层面；
2.加胰酶后，一定要在显微镜下观察，看到细胞回缩变圆，少许细胞漂起时，立即终止消化。9 P: I/ e! q' z7 ^+ I8 `- l
3.吹打制成悬液时要轻柔，尽量不产生气泡，因为气泡破裂时产生的冲击力很大，可将消化后的细胞破碎；
4.另外吹打的时候每个部位要到位。

作者: 大少爷 时间: 2012-3-3 08:44

显微镜下观察一下嘛

作者: xiaoqi 时间: 2012-3-3 08:46

补充一下：如果你感觉没有消化下来的细胞比较多的话，可以再加少许胰酶作用一下，这样就比较充分了。

作者: wuyannini 时间: 2012-3-3 10:00

我也补充一点，就是在倾去培养基之后，用PBS清洗一定要充分，一般2-3次，如果残留有血清成分则不利于消化。我的经验

作者: yyshpy 时间: 2012-3-3 11:00

给个建议是，加上消化液后，放镜下看，待绝大部分细胞变圆，界限清晰，细胞透明，表面有部分细胞漂浮，这时候就可以终止了，基本适用于所有细胞，

作者: cgc123 时间: 2012-3-3 11:22

最好还是在显微镜下观察，细胞间隙变大，收缩变圆就可以了，不要等到细胞都漂起来。有时候细胞生长的密度什么的都不一样，消化时间也会有些差异，所以还是显微镜下看一看比较好。

作者: mirrida 时间: 2012-3-3 12:13

  没那么复杂吧，这个消化度很难掌握的。我一般会采取两种办法：# p$ d$ H2 K8 c+ c8 A' q* {0 k
  一、让他过消化，然后全部洲际离心再加培养基培养；
  二、就是大部分消化了还有少许没消化，吸出大部分消化液，留少许，将细胞再静止1-2min,这样既可保证消化完全，有保证了不会太损伤细胞。

作者: zdgrp 时间: 2012-3-3 15:41

回复 xiongjiedeng 的帖子, y( z; R0 j0 C
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谢谢！我用的是六孔板，300ul，你说的2ml是用来消化多大的皿/孔？

作者: zdgrp 时间: 2012-3-3 15:42

回复 safflower 的帖子
5 J# Q) ?; x8 o9 M
谢谢！刚接触细胞培养，感觉手法对于细胞的状态有很大的影响，确实需要用心摸索！

作者: zdgrp 时间: 2012-3-3 15:44

回复 wuyannini 的帖子6 r6 n) g5 g; N* I" r1 r# F

嗯，我都是用PBS（六孔板每孔1ml的量）洗一遍，应该有这方面的原因，谢谢！

作者: zdgrp 时间: 2012-3-3 15:45

回复 mirrida 的帖子
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谢谢！但过消化是不是对于细胞状态有不好的影响？

作者: zdgrp 时间: 2012-3-3 15:46

回复 yyshpy 的帖子
% N" b- ?5 W( m4 j* F
谢谢！加消化液一般多长时间，可以在镜下看到你说的那种细胞状况？？

作者: yyshpy 时间: 2012-3-3 16:02

回复 zdgrp 的帖子# s3 {, u* _( P: n% J: `$ x6 n. z
: F! A2 x! q# X
消化液用量尽量少，能轻轻覆盖到细胞就行，消化时间嘛，与细胞属性密切相关，一般1~2min，就可以了

作者: yyshpy 时间: 2012-3-3 16:02

回复 zdgrp 的帖子- |* R- k1 W! h6 L" S6 {3 U
; J1 G- T1 @) x3 h+ ^! P4 E! ]' O9 q
消化液用量尽量少，能轻轻覆盖到细胞就行，消化时间嘛，与细胞属性密切相关，一般1~2min，就可以了

作者: xiongjiedeng 时间: 2012-3-3 21:39

回复 zdgrp 的帖子
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呵呵~我用的是10cm培养皿，那就不用那么多，用个400ul足够了

作者: wangfang 时间: 2012-3-4 12:45

1先将胰酶放在37度中温热，因为胰酶最适作用温度是37度。
2然后将培养皿内的培养液吸出
3用DOBS清洗，我们只清洗一遍
4加入胰酶，只有完全覆盖住皿底就可以了) V* D5 ]( m4 @, C# k' x, `4 [
5放回37度培养箱中，待细胞大部分变圆时轻轻的敲打培养皿使细胞飘起来
6加入终止液，离心即可。4 O$ h: }) l# d4 W! w
7这里面最重要的步骤就是消化时间的掌握和敲打培养皿的力度

作者: receiver1 时间: 2012-3-4 12:58

如果你感觉胰酶消化的太厉害，可能你的胰酶活力很强，可以把胰酶稀释一下再消化。我就是稀释的，根据自己的需要摸索一下浓度。我用的是0.15%的胰酶

作者: zdgrp 时间: 2012-3-4 13:17

回复 wangfang 的帖子
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敲打？怎么个做法？我都是轻轻晃。

作者: zdgrp 时间: 2012-3-4 13:18

回复 yyshpy 的帖子

嗯，谢谢！！

作者: wangfang 时间: 2012-3-5 07:47

用手轻轻敲打培养皿的侧壁

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 10:44

首先胰酶需要37度预热，在消化的时候其实不一定需要37度消化，室温其实也没有问题，消化时温和震荡，时间不要长，约2min后，在镜下观察即可。

作者: mirrida 时间: 2012-3-6 11:38

你试试，没多大影响的！

作者: redmaple 时间: 2012-3-7 21:31

我们实验室用的胰酶浓度是0.025%，买的商品化的0.25%的胰酶用pbs-0.5M的EDTA稀释10倍。我们用的是进口的，难道效果好？不同的细胞系，贴壁的程度不同，消化时间也不同，根据实际情况而定，消化之前，胰酶要37度抚育，酶的活性在此温度下最高，利于消化。

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