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标题:
关于胰酶消化细胞
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作者:
zdgrp
时间:
2012-3-2 21:58
标题:
关于胰酶消化细胞
最近养小鼠ES细胞，每次传代时用0.25%的胰酶消化，胰酶从4°冰箱拿出来后没有37℃预热，在超净台放到室温。感觉有时候消化的太厉害（超过3分钟），有时加培养液终止、吹匀的时候又有些贴壁没消化下来的，请教一下应该如何把握消化的时间？谢谢！
作者:
lingminliang
时间:
2012-3-2 22:16
胰酶的消化能力并不是一定的，不同的批次对不同的细胞的消化能力也不同，而且新配置的酶的消化能力较强，随着使用时间的延长，消化能力就降低。
作者:
xiongjiedeng
时间:
2012-3-2 23:17
从4℃出来要在37℃预热半个小时，效果会好很多；然后得看你的细胞了，不同的细胞对胰酶的反应不一样，还有细胞的密度也有关系，所以楼主要慢慢摸索，总结经验。我一般是用2ml的胰酶，消化2—3min足够了
作者:
safflower
时间:
2012-3-3 08:14
以下几点可能需要注意：
+ s; M1 |5 k' C$ j- m( D
1.一定要让胰酶均匀分布在整个培养板/瓶中，可以轻轻晃动使其均匀平铺于整个细胞层面；
5 J( S2 _4 B1 ^6 g
2.加胰酶后，一定要在显微镜下观察，看到细胞回缩变圆，少许细胞漂起时，立即终止消化。
7 t8 f! J4 C! }5 t/ W
3.吹打制成悬液时要轻柔，尽量不产生气泡，因为气泡破裂时产生的冲击力很大，可将消化后的细胞破碎；
6 a3 Z5 e: w* ?1 q
4.另外吹打的时候每个部位要到位。
( F. B$ V5 h4 ?" Q9 i0 u
作者:
大少爷
时间:
2012-3-3 08:44
显微镜下观察一下嘛
作者:
xiaoqi
时间:
2012-3-3 08:46
补充一下：如果你感觉没有消化下来的细胞比较多的话，可以再加少许胰酶作用一下，这样就比较充分了。
作者:
wuyannini
时间:
2012-3-3 10:00
我也补充一点，就是在倾去培养基之后，用PBS清洗一定要充分，一般2-3次，如果残留有血清成分则不利于消化。我的经验
作者:
yyshpy
时间:
2012-3-3 11:00
给个建议是，加上消化液后，放镜下看，待绝大部分细胞变圆，界限清晰，细胞透明，表面有部分细胞漂浮，这时候就可以终止了，基本适用于所有细胞，
作者:
cgc123
时间:
2012-3-3 11:22
最好还是在显微镜下观察，细胞间隙变大，收缩变圆就可以了，不要等到细胞都漂起来。有时候细胞生长的密度什么的都不一样，消化时间也会有些差异，所以还是显微镜下看一看比较好。
作者:
mirrida
时间:
2012-3-3 12:13
没那么复杂吧，这个消化度很难掌握的。我一般会采取两种办法：
~+ p \7 u& @( I2 z- n
一、让他过消化，然后全部洲际离心再加培养基培养；
( f) L' F, G- C, E2 |' {
二、就是大部分消化了还有少许没消化，吸出大部分消化液，留少许，将细胞再静止1-2min,这样既可保证消化完全 ，有保证了不会太损伤细胞。
作者:
zdgrp
时间:
2012-3-3 15:41
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xiongjiedeng
的帖子
8 L; \2 q3 ]7 P& E
+ o/ |3 \, `" L9 W% ~! Q, C% M8 f1 \" S
谢谢！我用的是六孔板，300ul，你说的2ml是用来消化多大的皿/孔？
作者:
zdgrp
时间:
2012-3-3 15:42
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safflower
的帖子
1 D' |1 c3 L3 Z v& w8 Z# v
7 x% T* Y O) v2 B7 `! [
谢谢！刚接触细胞培养，感觉手法对于细胞的状态有很大的影响，确实需要用心摸索！
作者:
zdgrp
时间:
2012-3-3 15:44
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wuyannini
的帖子
' v, ^. ~) d' @) c( [
8 j# p) N! L( ]+ n, W' R
嗯，我都是用PBS（六孔板每孔1ml的量）洗一遍，应该有这方面的原因，谢谢！
作者:
zdgrp
时间:
2012-3-3 15:45
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mirrida
的帖子
1 {0 U: n5 `. o- _
+ y: A' [ `" q( m
谢谢！但过消化是不是对于细胞状态有不好的影响？
作者:
zdgrp
时间:
2012-3-3 15:46
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yyshpy
的帖子
/ {; ^: Q* D; G
" R. Y. Q& k* f: Z- n3 ]2 ^ E t
谢谢！加消化液一般多长时间，可以在镜下看到你说的那种细胞状况？？
作者:
yyshpy
时间:
2012-3-3 16:02
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zdgrp
的帖子
2 W, D( }) f1 _
) c. g; @8 X J$ R
消化液用量尽量少，能轻轻覆盖到细胞就行，消化时间嘛，与细胞属性密切相关，一般1~2min，就可以了
作者:
yyshpy
时间:
2012-3-3 16:02
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zdgrp
的帖子
$ a" ]+ K$ O" J. t
0 v, U2 ~# K6 c. u6 m
消化液用量尽量少，能轻轻覆盖到细胞就行，消化时间嘛，与细胞属性密切相关，一般1~2min，就可以了
作者:
xiongjiedeng
时间:
2012-3-3 21:39
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zdgrp
的帖子
# c$ y- x t- F' c
7 N3 _6 i, E6 W( v
呵呵~我用的是10cm培养皿，那就不用那么多，用个400ul足够了
作者:
wangfang
时间:
2012-3-4 12:45
1先将胰酶放在37度中温热 ，因为胰酶最适作用温度是37度。
6 f' q/ _( W W3 W& I
2然后将培养皿内的培养液吸出
2 x1 ^3 I' h* o0 r5 b
3用DOBS清洗，我们只清洗一遍
" @4 q+ W" |! {, E% J+ Z5 H- }
4加入胰酶，只有完全覆盖住皿底就可以了
$ s# b# ~5 u% h. u9 ]
5放回37度培养箱中，待细胞大部分变圆时轻轻的敲打培养皿使细胞飘起来
4 U0 j% K# c. T% C3 Q5 t
6加入终止液，离心即可。
9 b9 O0 S; z( g) Z& {4 T
7这里面最重要的步骤就是消化时间的掌握和敲打培养皿的力度
作者:
receiver1
时间:
2012-3-4 12:58
如果你感觉胰酶消化的太厉害，可能你的胰酶活力很强，可以把胰酶稀释一下再消化。我就是稀释的，根据自己的需要摸索一下浓度。我用的是0.15%的胰酶
作者:
zdgrp
时间:
2012-3-4 13:17
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wangfang
的帖子
* i! V# ~% @+ K0 E2 a$ e
& ^+ H7 k6 i% n" S* o& g' \
敲打？怎么个做法？我都是轻轻晃。
作者:
zdgrp
时间:
2012-3-4 13:18
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yyshpy
的帖子
/ P% x- ?8 A4 p2 f9 B. N; M# G
( U3 f- a* O: G
嗯，谢谢！！
作者:
wangfang
时间:
2012-3-5 07:47
用手轻轻敲打培养皿的侧壁
作者:
mansnoopy
时间:
2012-3-5 10:44
首先胰酶需要37度预热，在消化的时候其实不一定需要37度消化，室温其实也没有问题，消化时温和震荡 ，时间不要长，约2min后，在镜下观察即可。
作者:
mirrida
时间:
2012-3-6 11:38
你试试，没多大影响的！
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作者:
redmaple
时间:
2012-3-7 21:31
我们实验室用的胰酶浓度是0.025%，买的商品化的0.25%的胰酶用pbs-0.5M的EDTA稀释10倍。我们用的是进口的，难道效果好？不同的细胞系，贴壁的程度不同，消化时间也不同，根据实际情况而定，消化之前，胰酶要37度抚育，酶的活性在此温度下最高，利于消化。
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