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标题: 关于饲养层细胞制作 [打印本页]

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 15:51 标题: 关于饲养层细胞制作

这两天正忙活小鼠MEF细胞，在懵懂干细胞的大力帮助下，终于建立起4批了。但其中有2只老鼠并没有严格按照12.5-14.5天的教科书式的实验步骤，而是请养动物的师傅按照肚子大小来粗略估计的。

有一直孕鼠肚子里的3只胚胎，都非常大了，胳膊腿都不太好往下拽，后背的皮肤还有点儿硬邦邦的，我还看到白色的类似骨头的东西，消化完了放到培养瓶，8小时之后观察，有很多细胞死的，比发育程度小的胚胎死得多很多，但也有部分细胞贴壁了，也在生长分裂，形态与MEF很相似。9 q1 B4 W8 v* n2 e
我有一个问题，为什么必须要12.5-14.5天的，有没有相关的文献，或者前辈们有没有经验，那些用非12.5-14.5天胚鼠建立起来的饲养层细胞，对ips或ES的生长有没有不良的影响？
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补充内容 (2012-3-5 16:18):2 u, ?) T. z! j1 G1 `
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！
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还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！6 R( X6 E- F* T# D7 ]$ i% w6 G

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还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！5 X+ V9 H& k) {2 E) \8 U/ w

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还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！
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补充内容 (2012-3-5 16:18):
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！

作者: song58 时间: 2012-3-5 16:04

请问，一只孕鼠怀了多少胎鼠？看胚胎大小，如果不是因为只有3～4个胎鼠的话，感觉至少是14天以上的了... 1 R2 V" ?5 [8 b0 I
还有，LZ进行原代细胞分离都不带个手套么，也不怕污染...

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 16:13

回复 song58 的帖子

嘻嘻，从来没带过手套，太贵了。我倒是害怕老鼠不干净~~% K( J' v! L4 N
我觉得这胚鼠是不小了，这窝就3只

作者: song58 时间: 2012-3-5 16:19

回复 yuhaoze 的帖子
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你们老板连手套都要省啊...太大的胎鼠做成MEF以后感觉细胞状态不太好，长的慢

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 16:19

晕，网不好，点了这么多次

作者: receiver1 时间: 2012-3-5 17:51

第二张图，你那胚胎也太大了，呵呵，感觉再过一两天就快出生了。取13.5天的胚胎做吧（胚胎很小的！如果肉眼看起来困难，可以放体视镜下操作），把头、尾、四肢和内脏（红色的一团）去掉，消化成单细胞接种，平均1胚胎的细胞接种到2个10cm皿，细胞长的很快。13.5天的胚胎，杂细胞最少！

另外，消化的时候，别消化的太厉害把细胞消化死了，呵呵。其实，MEF很好做的。" p0 d+ ~9 m4 q
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戴手套吧，别污染了，就白忙活了，记得加2X双抗。

MMC处理后大约三四天后会慢慢出现死细胞，一周左右大量死亡，但有些细胞能坚持到2周及以后。

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 18:05

回复 receiver1 的帖子
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谢谢！过两天MMC来了就处理看看

作者: jessewill 时间: 2012-3-5 19:33

MEF经过MMC处理之后，没有DNA复制能力了，但是怎么会一直在那里不死呢。。。？？？" M5 u/ X% f8 h

到了衰老的寿命也要死啊。。。。。。一般一个星期内用，3天左右最好。

作者: xiangchou812 时间: 2012-3-5 19:46

为什么这么强调带手套呢？% T* g, K; e5 j% `
戴手套就能避免污染了？这毕竟不是主要的。

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 20:08

回复 xiangchou812 的帖子! ] Y: v( ]3 M+ g' s1 u$ K
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作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 20:53

回复 jessewill 的帖子

有道理。原理，文献，有木有

作者: hanwei0610 时间: 2012-3-6 08:56

个人感觉13.5天的胎鼠发育大小比较适合做MEF：太小的话肉眼不易分辨；太大的话胚胎发育的一些血管甚至内脏都会影响MEF的贴壁，分离不好还可能混杂其他细胞，影响后期实验。3 A$ P- s% x1 s- g9 o
老鼠在做合笼前可以打激素做超排，这样能同时得到更多的胚胎。4 ]/ U/ X% W6 ~- O* ?$ V1 v& P
另外，感觉戴手套操作，不仅能预防污染，最重要的是防护自己，毕竟是动物操作。

作者: laurel101 时间: 2012-3-6 09:16

上个礼拜刚制备完一批MEF细胞。买的现成13.5天的CF-1孕鼠（350RMB/只），一只小鼠有12-19个胚胎不等，楼主的胚胎照片确实有点大。我当时是下午做的，约5-6个胚胎装一个150的培养瓶，第二天上午就非常满了，建议可以3个左右装一个150。制备MEF，避免污染是非常重要的，前期的培养基可以加入双抗。

作者: 573639471 时间: 2012-3-6 09:44

回复 laurel101 的帖子+ i6 A. z2 R" u" K

怎么联系买到的CF-1孕鼠啊？非常感谢啊

作者: 南宫燚岚 时间: 2012-3-6 09:48

回复 xiangchou812 的帖子9 U: T9 z0 t+ C! o6 p. t. W; t

戴手套操作我觉得这是一个无可争辩的事实，不需要争论！既保护自己，又避免样品污染。不能为了省一点小钱而影响实验。

作者: laurel101 时间: 2012-3-6 12:12

回复 573639471 的帖子. k1 B; L/ q1 y- L+ z) V- U# n) F
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上海斯莱克就有卖的

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:09

回复 hanwei0610 的帖子: B5 I4 K( a: p9 F) O3 j4 N

谢谢！

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:10

回复 laurel101 的帖子2 U* }+ c; L+ Z" `* M4 _
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谢谢！

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:10

回复南宫燚岚的帖子 y( l! T d" \/ u
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谢谢！还是保护一下比较好！

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:13

回复 laurel101 的帖子7 f: ]2 U% W% ?2 H# t H2 {, |
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想问一下，您是用什么方法将小鼠剪碎的，容器是啥，我用眼科剪子和青霉素小瓶子，不过论坛里有人批评说这样不太好

作者: laurel101 时间: 2012-3-7 09:00

回复 yuhaoze 的帖子( V* a2 v- F4 {9 B* I' k- n
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小鼠胚胎很容易剪的，我就把它们放100mm的dish,用眼科弯剪剪的。

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-9 21:53

回复 yuhaoze 的帖子
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feeder你不用怎么担心，3,4天内是没有问题的，再以后就会逐渐死亡

作者: 394290748 时间: 2012-3-12 08:07

回复 receiver1 的帖子. s$ z: \ W4 Z( C% D

你消化的时候一般消化多长时间？

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