干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 关于饲养层细胞制作 [打印本页]

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 15:51 标题: 关于饲养层细胞制作

这两天正忙活小鼠MEF细胞，在懵懂干细胞的大力帮助下，终于建立起4批了。但其中有2只老鼠并没有严格按照12.5-14.5天的教科书式的实验步骤，而是请养动物的师傅按照肚子大小来粗略估计的。1 k& k7 z* E$ ]7 T

有一直孕鼠肚子里的3只胚胎，都非常大了，胳膊腿都不太好往下拽，后背的皮肤还有点儿硬邦邦的，我还看到白色的类似骨头的东西，消化完了放到培养瓶，8小时之后观察，有很多细胞死的，比发育程度小的胚胎死得多很多，但也有部分细胞贴壁了，也在生长分裂，形态与MEF很相似。
我有一个问题，为什么必须要12.5-14.5天的，有没有相关的文献，或者前辈们有没有经验，那些用非12.5-14.5天胚鼠建立起来的饲养层细胞，对ips或ES的生长有没有不良的影响？) Q/ B: S. n9 y5 ?9 Y

补充内容 (2012-3-5 16:18):$ \! u2 q- A3 i
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！

补充内容 (2012-3-5 16:18):
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！
2 }' [- w7 d1 t1 L/ V/ Q- c
补充内容 (2012-3-5 16:18):
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！0 N5 k7 K' s5 g. d, J$ Y' d

补充内容 (2012-3-5 16:18):- t; c& q5 e+ ?2 e: o) f4 \
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！2 B- h: ^/ I3 Y6 M

补充内容 (2012-3-5 16:18):
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！
) R# Y8 O; F2 D9 k2 b- \
补充内容 (2012-3-5 16:18):! P, N3 C& L0 B
还有一个问题，就是MEF经过MMC处理之后停止分裂，会一直贴在哪里不死吗？最后MEF就怎样了？谢谢！

作者: song58 时间: 2012-3-5 16:04

请问，一只孕鼠怀了多少胎鼠？看胚胎大小，如果不是因为只有3～4个胎鼠的话，感觉至少是14天以上的了... 1 t, q2 q& _1 S8 e" Q( V
还有，LZ进行原代细胞分离都不带个手套么，也不怕污染...

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 16:13

回复 song58 的帖子$ `2 i8 `1 l* v0 H* z' P

嘻嘻，从来没带过手套，太贵了。我倒是害怕老鼠不干净~~0 T7 T8 u% F) K; p+ [) N/ A
我觉得这胚鼠是不小了，这窝就3只

作者: song58 时间: 2012-3-5 16:19

回复 yuhaoze 的帖子8 b2 x. ~& g8 }! v$ h+ x0 E
" f6 w+ s9 V9 ~/ F( G7 E) Z, o# s* B
你们老板连手套都要省啊...太大的胎鼠做成MEF以后感觉细胞状态不太好，长的慢

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 16:19

晕，网不好，点了这么多次

作者: receiver1 时间: 2012-3-5 17:51

第二张图，你那胚胎也太大了，呵呵，感觉再过一两天就快出生了。取13.5天的胚胎做吧（胚胎很小的！如果肉眼看起来困难，可以放体视镜下操作），把头、尾、四肢和内脏（红色的一团）去掉，消化成单细胞接种，平均1胚胎的细胞接种到2个10cm皿，细胞长的很快。13.5天的胚胎，杂细胞最少！

另外，消化的时候，别消化的太厉害把细胞消化死了，呵呵。其实，MEF很好做的。
; `4 j) B5 ~) p% e9 b# d+ h
戴手套吧，别污染了，就白忙活了，记得加2X双抗。

MMC处理后大约三四天后会慢慢出现死细胞，一周左右大量死亡，但有些细胞能坚持到2周及以后。

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 18:05

回复 receiver1 的帖子

谢谢！过两天MMC来了就处理看看

作者: jessewill 时间: 2012-3-5 19:33

MEF经过MMC处理之后，没有DNA复制能力了，但是怎么会一直在那里不死呢。。。？？？* g9 v8 S# p% e* E
+ l2 s. A9 d# x/ y, |& I" V6 f
到了衰老的寿命也要死啊。。。。。。一般一个星期内用，3天左右最好。

作者: xiangchou812 时间: 2012-3-5 19:46

为什么这么强调带手套呢？$ x! `4 I+ G% M0 a
戴手套就能避免污染了？这毕竟不是主要的。

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 20:08

回复 xiangchou812 的帖子

:D:D:D:D

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-5 20:53

回复 jessewill 的帖子

有道理。原理，文献，有木有

作者: hanwei0610 时间: 2012-3-6 08:56

个人感觉13.5天的胎鼠发育大小比较适合做MEF：太小的话肉眼不易分辨；太大的话胚胎发育的一些血管甚至内脏都会影响MEF的贴壁，分离不好还可能混杂其他细胞，影响后期实验。
老鼠在做合笼前可以打激素做超排，这样能同时得到更多的胚胎。& @3 d. [& Z, q! c4 l7 G2 n
另外，感觉戴手套操作，不仅能预防污染，最重要的是防护自己，毕竟是动物操作。

作者: laurel101 时间: 2012-3-6 09:16

上个礼拜刚制备完一批MEF细胞。买的现成13.5天的CF-1孕鼠（350RMB/只），一只小鼠有12-19个胚胎不等，楼主的胚胎照片确实有点大。我当时是下午做的，约5-6个胚胎装一个150的培养瓶，第二天上午就非常满了，建议可以3个左右装一个150。制备MEF，避免污染是非常重要的，前期的培养基可以加入双抗。

作者: 573639471 时间: 2012-3-6 09:44

回复 laurel101 的帖子2 [- G6 k" A1 \) x4 }

怎么联系买到的CF-1孕鼠啊？非常感谢啊

作者: 南宫燚岚 时间: 2012-3-6 09:48

回复 xiangchou812 的帖子
/ _% `( n) J/ Q
戴手套操作我觉得这是一个无可争辩的事实，不需要争论！既保护自己，又避免样品污染。不能为了省一点小钱而影响实验。

作者: laurel101 时间: 2012-3-6 12:12

回复 573639471 的帖子

上海斯莱克就有卖的

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:09

回复 hanwei0610 的帖子

谢谢！

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:10

回复 laurel101 的帖子0 B7 D9 u y# D2 A% D$ b

谢谢！

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:10

回复南宫燚岚的帖子

谢谢！还是保护一下比较好！

作者: yuhaoze 时间: 2012-3-7 08:13

回复 laurel101 的帖子
2 R6 B, I5 i) r o7 k$ `
想问一下，您是用什么方法将小鼠剪碎的，容器是啥，我用眼科剪子和青霉素小瓶子，不过论坛里有人批评说这样不太好

作者: laurel101 时间: 2012-3-7 09:00

回复 yuhaoze 的帖子

小鼠胚胎很容易剪的，我就把它们放100mm的dish,用眼科弯剪剪的。

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-9 21:53

回复 yuhaoze 的帖子

feeder你不用怎么担心，3,4天内是没有问题的，再以后就会逐渐死亡

作者: 394290748 时间: 2012-3-12 08:07

回复 receiver1 的帖子

你消化的时候一般消化多长时间？

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)