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标题: 酶消化法分离培养脐带间充质干细胞 [打印本页]

作者: 细胞干 时间: 2012-3-8 12:33 标题: 酶消化法分离培养脐带间充质干细胞

最近摸索了一段时间，还没成功，有一些经验，但也有迷惑，蹦出来分享并求解：; B; C1 Y! [9 q& \) i1 \+ j! Z
首先，洗净脐带，用剪开浆膜（最好从两根动脉之间），依次剔除两根动脉，静脉就不剔了，因为静脉壁很薄，跟周围胶体连接很紧。再用有齿镊提起胶体，顺脐带轴方向剪下细长条状，再将其剪成小块，最好1~3mm3
然后，消化前将组织块PBS洗两遍，0.1%胶原酶2消化4h，接着加0.25%胰酶消化30min。因为消化液很黏稠，加PBS稀释，过滤。
离心我是用的1500，10min，但是昨天做的感觉离心力不够，离心下来细胞不是很多。. I$ S( J! E+ a1 k8 _" h
求解：1. 消化液稀释后仍然很黏，是不是要加大转速或延长离心时间？以前试过3000,10min，但是有很多杂质。求合适的转速及时间！. d4 }) H1 X7 I/ D0 Z
2. 过滤的时候会不会胶原蛋白堵塞网孔，导致细胞滤不下去啊？有办法解决吗？
3. 个人感觉胶原酶消化4h，还是有点短，请问当组织块消化到什么状态说明消化的差不多了。

作者: jiangfengde 时间: 2012-3-8 17:17

我第一次做的时候消化液也很粘稠，根本滤不过去，建议将消化液分装，用大量PBS也清洗，大概10到20倍体积，只要稀释的够，过200目没问题。关于离心转速和时间，可以采用密度梯度离心，先2500r/min,15分钟，取上清稀释后再1500r/min,10分钟，最后再800r/min,5分钟，据说效果不错，不妨一试。消化时间不好掌握，要根据组织块多少来定，摸索中......

作者: 小豆 时间: 2012-3-9 08:46

楼主的转速、时间好像有点偏差，我赞同二楼的，你是否试试换个酶？

作者: xiaolong 时间: 2012-3-9 08:56

回复细胞干的帖子
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借问一下楼主，如果静脉不剔除，在培养间充质细胞是，不可避免的会有静脉细胞大量的出现，你怎么纯化间充质细胞？6 k& w5 v+ M9 R1 ^% f
另附：只要你消化的时间合适，胶原蛋白是不会影响细胞过滤不过去的，胶原蛋白比细胞小的多

作者: 细胞干 时间: 2012-3-9 09:45

不会出现静脉细胞，只要剪下胶体，静脉留下来，3cm一段，胶体够用了

作者: 细胞海洋 时间: 2012-3-10 00:13

回复谁的问题就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样; g, Y0 h8 P" x
c5 }# w% g" v7 U$ @6 y+ e
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作者: yangwy028 时间: 2012-3-10 08:54

楼主这样的方法貌似根本就不能够养出来细胞的。敢问楼主是否曾经养出来过间充质细胞？形态一切都正常吗？静脉其实不难剥离啊。但是如果不剔的话影响很大的，养出来的细胞太杂。楼主您说话这么肯定，是实验成功了吗？

作者: 上帝帮我转运吧 时间: 2012-3-10 09:53

回复细胞干的帖子: u. Q3 G1 o# Y- Z- I* b# u9 b2 \
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1、胶原酶消化时我稀释了四倍，感觉还可以。) N" w0 ?7 K2 [2 Q
2、静脉不难剔除，一、可以先从静脉管周围的胶剥下来，然后静脉管壁就会显露出来，就可以直接拿掉，这样很好弄；二、你也可以从静脉管中间先撕开，然后把那层薄薄的壁拿掉也可以。为了纯度，还是尽量把静脉管拿掉吧。

作者: andylee824 时间: 2012-3-12 10:44

第一，要尽可能剪碎，1平方毫米吧；第二，10倍稀释后离心。第三，离心，我都是用 3000,10min，反正后面还用筛网；第四，胶原酶消化要至少8小时吧。

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