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标题: Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题 [打印本页]

作者: runsong 时间: 2012-3-22 17:28 标题: Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

作者: zxcv12345 时间: 2012-3-22 17:28

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蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。" o5 v5 }( T0 [# x; u4 [9 I
4 _' A2 t% C7 T( i4 G
在冻存前，可降低浓度。
如果不容易降解，可考虑4度保存

作者: zxcv12345 时间: 2012-3-22 18:38

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蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
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在冻存前，可降低浓度。
如果不容易降解，可考虑4度保存

作者: runsong 时间: 2012-3-22 21:56

回复 zxcv12345 的帖子2 `( p* N7 q% z- z1 q. O% T

谢谢。还有几个问题。 u) R7 H8 g$ Z: R& q2 ]
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？. z4 H/ ~! x: [# V( `3 q% _$ z
2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？
3、我所用的裂解液有改进的必要吗？" Q. A7 }* R \

作者: zzzhouzhong 时间: 2012-3-23 10:03

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40 2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

作者: zxcv12345 时间: 2012-3-25 21:00

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1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul) b" @, G2 L( R, K
2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大
3.裂解液的问题应该不大

作者: sykbod 时间: 2012-3-26 22:31

回复 runsong 的帖子9 G" }' c; V! P, U

1.    5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits.
2.    Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.
3.    Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? ...
      generally, your lysis buffer should be good.! a, L7 a; k. A4 t+ m. ]; @

作者: cjian6352 时间: 2012-4-6 12:27

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

作者: biotly 时间: 2012-4-18 17:51

回复 zzzhouzhong 的帖子 j% O4 A( _4 s, @& f

这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

作者: YYQ6301 时间: 2012-5-2 14:18

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存

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