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标题: 关于可调控表达的慢病毒包装系统 [打印本页]

作者: salomemao 时间: 2012-3-26 23:35 标题: 关于可调控表达的慢病毒包装系统

各位大侠好，最近想用慢病毒包装系统筛选几株稳定敲降干性相关基因的干细胞，但是考虑到如果这些基因被稳定敲降的话，干细胞肯定会发生分化，之后的细胞培养也可能无法进行，所以想到利用tet-on或tet-off系统，希望能将这两种技术相联系，得到可以调控表达的干细胞。addgene上有几个这样的质粒，我也正在准备联系购买，但是可能程序比较复杂，还有就是买来以后不知道效果如何。现向各位请教一下，大家知道哪些质粒能达到我上面所说的效果，效果比较好的，谢谢大家

作者: 吹泡泡的鱼w312 时间: 2012-3-27 08:27

刚进入此行，一窍不通，不过我现在设计的第一个实验的第一个步骤就是慢病毒转染目的基因进入Hep-2，以后要多请教各位前辈们了，哈哈。你也好好加油做吧~西西

作者: salomemao 时间: 2012-3-27 13:56

谢谢，呵呵。共同努力

作者: BNJN 时间: 2012-3-28 12:00

可以先建立rtTA的细胞系，再把连在pTight载体上的质粒用病毒感染，养好之后用Dox筛选。我实验室都这样建系的

作者: salomemao 时间: 2012-3-28 14:13

这几天在addgene上买了几个相关的质粒，等待质粒到后验证一下效果，好的话回来和大家交流

作者: zack 时间: 2012-5-24 00:23

本帖最后由细胞海洋于 2012-5-24 10:51 编辑

根据我们公司的系统，分别构建两个质粒：EF1A-rtTA-IRES-报告基因;Tre-目的基因-IRES-报告基因。先用rtTA的质粒转细胞获得稳转细胞株后，再用Tre质粒包装成慢病毒转染rtTA细胞株。希望对您有用。

作者: 小木梅 时间: 2012-11-21 21:33

回复 zack 的帖子% P' [; A/ Q- p; D+ b* |; {

你好，我对这块不太了解，你能解释一下这两个质粒各自的作用和这个方法的原理吗？

作者: zack 时间: 2012-11-29 11:40

回复小木梅的帖子0 J! }0 o# y0 e7 w$ W+ r/ A4 \ H/ i

诱导型表达是指在诱导型启动子的驱动下，例如TRE，需要rtTA 这样的转录激活因子和doxycycline 药物的存在下，才能表达下游的基因。

作者: Morpheus 时间: 2013-5-11 08:28

回复 zack 的帖子4 M) U6 Y% ]) O/ \3 l. A6 b: V
: L$ O v* l3 ?
您好！请问如何获得Mrt 的稳转细胞系呢？也是加药筛选吗？是抗哪种抗生素的呢？谢谢！期待您的回复

作者: 细胞海洋 时间: 2013-5-11 23:09

回复 Morpheus 的帖子
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作者: zack 时间: 2013-5-28 08:30

回复 Morpheus 的帖子
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非常抱歉，有一段时间没有登录论坛了。如若构建两个质粒，一般都需要分别添加Puro和Neo抗性的。构建Mrt稳转细胞系的质粒简易图谱为：Tre-Mrt-PGK-Puro和Promotor（EF1A）-rtTA-PGK-Neo。如若有不明白的地方，请随时联系或者咱内短信我。

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