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标题: oct4 基因在普通细胞中表达吗 [打印本页]

作者: fanmihu1987 时间: 2012-3-27 09:02 标题: oct4 基因在普通细胞中表达吗

近日在普通细胞中提取RNA，反转录，扩增出OCT4 NANOG 基因。求指点

作者: song58 时间: 2012-3-27 10:19

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什么普通细胞？有用什么处理过吗？

作者: igdb 时间: 2012-3-27 10:28

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是否是假基因？建议设计跨内含子的引物重新作一下

作者: fanmihu1987 时间: 2012-3-27 11:33

普通的成纤维细胞没处理过。引物是跨内含子设计的每个基因不止一对

作者: 新疆八钢 时间: 2012-3-27 11:58

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普通细胞没有做过，肿瘤细胞系表达很高

作者: jefferson 时间: 2012-3-27 14:27

是做的什么PCR，这些基因在HDF细胞中是不表达的，或者，表达量相当低，普通PCR或者RT-PCR应该都难以检测的到。5 k7 u9 z& u- H5 t0 z4 o
- }5 D& P1 @0 u( L8 o
但在一些Paper里，在做ips的鉴定时，用Q-PCR检测多潜能性基因的表达量时，有的是用HDF作为参比的。就是说，扩增HDF细胞中的这些基因，包括OCT4,NANOG等作为标准，其结果定义为1。这样的话，说明在HDF细胞中是可以扩增到的，但我扩了两次，量太低或者没扩出来。

作者: fanmihu1987 时间: 2012-3-27 14:31

回复 jefferson 的帖子5 E/ B0 G8 W( S- H" k
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我就是普通的RT-pcr,普通的胎儿成纤维细胞。条带清晰

作者: jefferson 时间: 2012-3-27 14:35

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很有可能确实是表达的，尤其是在胎儿的细胞里。 C& u, ^/ o! r: Z) J- u% w& `. F9 ]! k
7 c6 s6 T0 p% `3 ^5 N
想起来以前做过一次RT-PCR，在成人HDF细胞中也扩出了NANOG。' F# h% @: V8 F" N5 X0 O

是否是这些基因在成体细胞也表达，但量较低而已？

作者: song58 时间: 2012-3-28 10:07

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细胞分离过程没有被其他细胞污染吧？
或者胎儿的就有一点？& j' D7 r0 E7 i V
或者再检查一下引物？找个以前测过的阴性对照再P一下吧？

作者: lcxlorna 时间: 2012-3-28 11:45

普通的成纤维细胞应该P不出来，考虑细胞污染等问题。

作者: jefferson 时间: 2012-3-28 14:54

由于来源于胎儿的HDF，细胞污染是应该考虑的一个问题。
0 X$ v2 G( r7 t/ t* O
此外，有文献报道，OCT4, NANOG, 以及另一种多潜能性基因Stella都存在假基因。OCT4有6种假基因，NANOG有10种。此外，有文献报道NANOG基因在成体组织中也有表达。因此利用RT-PCR检测的时候，引物设计就很重要了，要避免假基因对结果产生的干扰。所以出现这种情况，应该是所用的引物扩出了假基因。
8 d1 n% m$ Q, R
附两篇相关的文献以供参考，希望对你有帮助。7 J- `, M0 d0 q: k1 P
9 N1 a* G5 m3 l% w( k
1. Multiple retropseudogenes from pluripotent cell-specific gene expression indicates a potential signature for novel gene identification. J Biol Chem. 2005 Feb 25;280(8):6265-8. Epub 2005 Jan 6.
' d/ h& D/ H' O n) G- y) C& `! W
2. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human。Dev Dyn. 2004 May;230(1):187-98.

作者: tinatina 时间: 2012-3-28 15:49

Oct4本身是多能性的标志，在Pluripotent stem cells 中表达高，终末分化的细胞中低，所以在做PCR时，一定要有negative control 和positive control，这样才可以是的自己的样品表达水平

作者: fanmihu1987 时间: 2012-3-28 15:54

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9 V6 j4 J/ {, e) w1 o
十分感谢您的帮助

作者: fanmihu1987 时间: 2012-3-28 15:55

回复 tinatina 的帖子- h6 y- j$ F8 [% m4 o7 c. ~( u

谢谢您的回答！还想请教您positive control应该怎么做？

作者: tinatina 时间: 2012-3-28 16:02

最标准是in vitro transfection, 做一个过表达的细胞系。当然可以用ES做对照

作者: fanmihu1987 时间: 2012-3-28 16:04

回复 jefferson 的帖子6 T7 g$ F, d0 [& Z# K) F
! Z2 R S8 ~9 D1 z* ~
谢谢您的回答，还想请教细胞污染指的是什么？

作者: tinatina 时间: 2012-3-28 16:08

狭义：细菌，真菌，病毒，支原体，衣原体
广义：杂细胞，非目标细胞，不正常分化

作者: jefferson 时间: 2012-3-28 16:32

fanmihu1987 发表于 2012-3-28 16:04
- O' G; n" c/ ?) B/ k1 ^" h回复 jefferson 的帖子2 ?9 Y. G: w% W2 y3 u
2 y* u2 K) e8 S6 j$ s" F5 }
谢谢您的回答，还想请教细胞污染指的是什么？

! H: {! a8 H$ n1 ~
不知道你的胎儿HDF是自己分离的，还是细胞株

由于OCT4在干细胞或者生殖系细胞中都高表达，NANOG在一些成体组织中也有表达，因此如果是自己分离的胎儿HDF，有可能一起分离到了出HDF之外的其他组织细胞，而这些细胞或有可能就表达OCT4或NANOG。

不过个人认为，RT-PCR引物设计不当，扩增出假基因的可能性很大，建议看下那两篇文献。

作者: liufutang 时间: 2012-3-28 18:39

回复新疆八钢的帖子8 B% ^6 s# ]0 Q+ [& o C( W

你检测过什么肿瘤细胞系表达OCT4呀？我检测的只有在畸胎瘤中表达

作者: 新疆八钢 时间: 2012-3-29 16:49

回复 liufutang 的帖子$ u2 d- ^$ Q# h
" v1 w' X2 Z- I4 L! p# ~: ?# Y! s
胰腺癌细胞系：Bxpc-3,Panc-1

作者: liufutang 时间: 2012-3-31 07:08

回复新疆八钢的帖子) q4 C5 [3 m$ ^2 W, q, ~( \% C% |

哈哈这个我还没试过哈

作者: snokey 时间: 2012-4-17 16:03

OCT4分OCT4A,OCT4B和OCT4B1三种，另外OCT4有6个假基因。一般文献中的引物使用的引物大部分都没有区分出OCT4A, OCT4B，OCT4B1和假基因。只有OCT4A和干细胞的多能性相关，而很多细胞中都可以检测到OCT4B和OCT4B1，所以你检测到OCT4并不奇怪。关键要看你的引物设计的位置在哪里。OCT4中之用OCT4A含有第一个外显子，所以OCT4A特意性的引物一定要跨第一个外显子。另外，即使你可以区分OCT4A和其他异构体，但很难彻底避免PCR会扩增出非特异性条带，因为OCT4假基因和OCT4A的序列同源性至少大于97%。唯一可靠的是功能实验，因为OCT4A是转录因子，在核里，OCT4B不起转录因子的作用（在细胞质里），假基因没有蛋白产物。

作者: snokey 时间: 2012-4-17 16:06

一些成体干细胞中有低水平的OCT4A表达，但是随传代次数增加而降低。

作者: frankieisme 时间: 2012-4-24 00:09

MEF细胞我做过,是扩不出来的 .

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