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标题: 求助，大家帮忙看下iPSC上的小圆点是什么？ [打印本页]

作者: ligangtiancai 时间: 2012-3-31 20:17 标题: 求助，大家帮忙看下iPSC上的小圆点是什么？

如图，本人的iPS上有很多发亮的小圆点，怀疑是支原体，但也无法确认，大家帮忙鉴定下，谢谢！" T( X" _5 t% k0 S: H4 z! N, G
P.S iPSC在做EB时EB周围死细胞较多，是否和此小亮点有关？

作者: guoanson 时间: 2012-3-31 21:01

不一定是吧，我养的鼠的细胞也会有~

作者: cicadacjk 时间: 2012-3-31 21:58

那是正常的

作者: xyklmu 时间: 2012-3-31 22:41

不可能是支原体，支原体在光学显微镜下看不到的。普通光学显微镜的分辨率在0.2um左右，而支原体的大小在0.1um左右。会不会是空气中的某种孢子，有时聚集在干细胞周围。我做神经干细胞培养的时候，也发生过真菌孢子的污染情况，严重的时候，细胞周围都是这样的小圆点，而且会动，细胞也逐渐死亡。

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作者: sfk06 时间: 2012-3-31 23:17

回复 ligangtiancai 的帖子; {0 o u; F8 @' j
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不是支原体，支原体在相差镜下看不到，可能是些细胞碎片

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 00:18

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空气中的孢子？不会吧，我用的是带滤膜的培养瓶。。。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 00:19

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正常么，可我问导师她说虽然不明确，但感觉不是好东西、。。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 00:19

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请问那你后来怎么处理的

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 00:20

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我开始也怀疑是细胞碎片，但每次刚一传完代就会有一些，感觉不太像碎片。

作者: 抹了个茶 时间: 2012-4-1 01:40

。。。你肯定是用ko养的用ko就是这样这是正常的、、、、、、、、

作者: Demon_CN 时间: 2012-4-1 09:18

换个液还有就不是细胞碎片。

作者: 雁南飞 时间: 2012-4-1 09:37

是不是油滴？油红染一下试试

作者: wcfeng88 时间: 2012-4-1 10:40

每次发现这种状况的出现，都是在我比较粗暴的对待细胞（比如用力吹打细胞，胰酶消化过度），或者细胞比较老后才传代时发生的。一般再传一两代就会好转了。

作者: cicadacjk 时间: 2012-4-1 10:51

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bingo，就是脂滴! s' X0 F2 @4 }/ a2 r
楼主不要再纠结了

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 12:03

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脂滴？可是我每次换液后还都有。。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 12:05

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不过我每次吹打都比较用力，而且用的是自己配的（0.25Trypsin+0.02EDTA）胰酶消化液很快，不会真的是这个原因吧

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 12:05

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换液后还是有的，而且不见少

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-1 13:18

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我用的不是KO，就是有一家叫PAA的高糖DMEM

作者: XIE冬D 时间: 2012-4-1 13:22

应该是细胞碎片吧，我的小鼠细胞也有这种情况，可能是消化的时候消化过了，可以试试缩短消化时间，或者改用温和的酶消化。我试过Accutase跟typle比胰酶温和，情况好转多了。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-2 15:59

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请问你在使用胰酶消化的时候速度如何。我在用自己配的0.25%胰酶（+EDTA0.02%）和0.05%胰酶（+EDTA 0.02）以及PAA的0.25%胰酶，iPS的消化速度都非常快，20sec就都下来了。感觉是不是因为iPSC收到支原体或者什么的影响，状态不好，脱壁特别快。。。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-2 16:00

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请问你在使用胰酶消化的时候速度如何。我在用自己配的0.25%胰酶（+EDTA0.02%）和0.05%胰酶（+EDTA 0.02）以及PAA的0.25%胰酶，iPS的消化速度都非常快，20sec就都下来了。感觉是不是因为iPSC收到支原体或者什么的影响，状态不好，脱壁特别快。。。

作者: XIE冬D 时间: 2012-4-2 23:07

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我用的胰酶是GIBCO的，不是自己配的，2分半时钟差不多就可以下来，但是还不是单个细胞。我觉得你的是消化太厉害了，或者自己配的消化强度大些？你们实验室其他人的也这样么？如果怀疑是支原体的话，可以定期取细胞培养液做一下支原体检测。

作者: XIE冬D 时间: 2012-4-2 23:14

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估计就是吹打太用力了，我师兄说细胞磕不死但是会被吹死，所以如果未成单个细胞可以终止消化，轻轻磕一下，另外，消化时间一定不能过长，如果不放心的话，可以镜下观察，我之前不能把握消化力度的时候就是这么干的。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-2 23:37

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我的iPS消化非常快，基本上加进去、过火封口、再镜下观察（合计小于30s），细胞就已经脱壁了，用了2种自己配的胰酶（+0.02EDTA）和一种PAA公司的胰酶（无EDTA）都是这种情况，而且是整个克隆都下来了，然后再吹打上20次左右基本就成单细胞了。。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-2 23:38

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能给我说一下你使用的胰酶的货号么，谢谢！

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-2 23:40

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是不是我的细胞已经受到什么影响导致贴壁能力下降、消化过快？

作者: wolfgang 时间: 2012-4-5 09:32

以我个人的经验，我觉得基本可以确定是支原体，楼主最好去做支原体检测，支原体阳性dapi染色可以看出细胞核和细胞外面都有雾状蓝色出现。黑点不是支原体聚集造成，而是细胞在应激状态下的代谢产物。支原体对于重编程和分化进程影响很大，造成实验根本没法做，我等深恶痛绝！

作者: ligangtiancai 时间: 2012-4-5 11:34

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好的我明白了，准备扔了，谢谢！

作者: dilal 时间: 2012-5-3 16:45

支原体肉眼不可见，细胞状态还行，饲养层感觉有些老化了，

作者: 184lj 时间: 2012-6-13 21:28

收集细胞培养液，PCR检测一下，就知道是不是支原体污染了。

作者: playboy723 时间: 2012-6-20 08:37

我以前在做小鼠MEF的时候发现在小鼠身上就有这个东西，所以应该是做原代培养时从小鼠身上带下来的东西，这个东西在细胞状态好时一般不出现，一旦当细胞状态稍微不好时便大量产生，换液也不好使，只有消化下来低速离心2次才会少些，但也是完全清除不了。如果你的ES细胞有抗药标记那就好办多了，直接加G418或杀稻瘟菌素培养几代就OK了。曾经深受其害，至今仍深恶痛绝！

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