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标题: 请教真菌污染的检测方法 [打印本页]

作者: 上帝帮我转运吧 时间: 2012-4-6 18:02 标题: 请教真菌污染的检测方法

请教真菌污染的检测方法，以及细菌污染的检测方法。经验不足，目视可信度有点小。本着快速灵敏的原则，都有什么方法，谢谢！

作者: geminigg 时间: 2012-4-6 22:56

看你要检测什么东西了。要是培养基，直接放一滴到皿里培养24hr，估计就能看出来了。

作者: geminigg 时间: 2012-4-6 22:57

网上搜到了一个各种污染的整理4 G; a5 i6 t9 b4 a# i6 C
http://www.med66.com/html/ziliao/yixue/11/72afaa5ec9ae03edea662cbdc7a87c6d.htm
细胞培养中常见的污染情况总结如下:
常见的污染如下：
1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。% R  e3 r, R; h
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！9 U8 q! ~, J7 w  q
可在培养液中加相应的抗生素处理

2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，
用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。, W4 `) k; [! ~6 o
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 7 M; z, \* @0 m

3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。
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4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。: Z7 ]1 ?# f" X6 h4 T. @/ `# L

5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。* w1 R/ z6 f0 x' V

6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等7 X$ F. i  B: T  q
关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长就是操作的问题。
也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。

1、孵箱应定期用三氧机消毒或者紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素' V% W; y* _: l; {$ ?, `
3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染0 _4 Q* T' @* @6 A) ]4 c5 ~' \( \
4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。

作者: 上帝帮我转运吧 时间: 2012-4-6 23:24

回复 geminigg 的帖子1 H n }4 z: w! [% G+ R
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非常感谢。我目的想知道是具体的检测方法，就是有一个结果，比如用培养法测细菌，或凝胶法测内毒素及PCR测支原体等。镜检目视的方法不包括呵呵。最想知道的是有没有快速检测是否真菌污染的方法。

作者: jkfly 时间: 2012-4-11 09:32

有测试的工夫不如扔掉重新养，如果不是珍贵的细胞的话，真菌的特点是一般培养基还是清澈的，不是浑浊的，真菌污染长的也较慢，你可以拍照给大家看一看

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