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标题: 脂肪干细胞的提取问题 [打印本页]

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-10 22:35 标题: 脂肪干细胞的提取问题

哪位高手知道提取脂肪干细胞的提取都需要哪些试剂啊？本人想做一次脂肪干，了解到一些试剂，胶原酶1是必须的吧?红细胞裂解缓冲液有需要吗？是不是用来终止酶的？

作者: 相宜 时间: 2012-4-10 23:23

I型胶原酶，双抗，pbs，胰酶 EDTA FBS，至于红细胞裂解液个人觉得不用也行，但是还要看自己呀

作者: 相宜 时间: 2012-4-10 23:25

DMEM培养基，有的说用高糖，低糖和F12 这个楼主在多查查文献选择下自己合适的吧

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-11 09:06

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! _& {- T5 T. @
请问EDTA是用来终止胶原酶的吗？要什么浓度？

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-11 09:10

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高糖低糖的培养基是干什么的哦？我在文献上都没看见过啊！

作者: Demon_CN 时间: 2012-4-11 09:57

1用抽脂机抽取脂肪，建议将脂肪颗粒打碎
2用 I型胶原酶37℃恒温摇床消化 1h，期间需反复震荡混匀（最好用振荡摇床）。
3 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗)中止消化。, N" P# x) I& v- r5 n' R0 w
4 消化后的匀浆用200微米的滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔。
5 1000转离心10min（成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是脂肪干、还有其他细胞）, j1 }. b4 `& s* i$ d
离心后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，1000r10min离心。重复此过程数次。（进一步纯化）% j: Y0 @+ R( F
将清洗干净的脂肪细胞用完全培养基重悬，计数。$ b' l5 T$ w2 E6 t, P: B
6接种按10000个cell/m20 w2 n& W: V+ I
! y+ Y5 N+ N/ `

EDTA是用来辅助胰酶消化的不是用来终止的，终止消化用含蛋白量大的比如胰酶。4 m! E( k6 [. W" l. p7 c3 D- s1 _
EDTA用来螯合二价离子，二价离子的存在会抑制胰酶活性

DMEM用低糖的，高糖会促进分化。$ J% ~: H: |3 y
高低糖的区别就是基础培养基含糖的不一样（低糖DMEM与葡萄糖为1100毫克/升，高糖DMEM为4500毫克每升，。）

作者: owenlion 时间: 2012-4-11 11:06

楼上的朋友们说的都可以，根据我的经验，IV型胶原酶也可以，消化时间也可以延长点。另外可以直接培养脂肪组织，也可以长出贴壁的MSC

作者: 荷荷 时间: 2012-4-11 12:43

1.拿到脂肪组织后用生理盐水或者PBS洗至无血色，离心，弃上层液体；: j/ a; V8 \4 R& _/ Z: L
2.加入适量I型胶原酶，摇床220rpm 30分钟，观察脂肪组织成糜状即可；" }+ r; x$ n7 ~: R6 W2 s& O/ c
3.加入等量完全培养基（低糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗）终止消化；/ @- x: K, p- {) i* j
4.离心或静止片刻，去除上层油脂，100微米滤器过滤；( a( L) I$ S) s2 W0 y" m+ o
5.1200rpm 8min，弃上清，加入pbs重悬，1200rpm 8min；
6.弃上清，计数，1200rpm 8min；7 F) Q1 Z4 J& A( s
7.接种细胞密度10的6次方/毫升。3 \% ^/ h9 x! j1 ]: U+ e
: s ], o7 O1 F$ s* S+ g( k
注意：pbs清洗过程中尽可能的去除油滴；第5步离心后根据个人习惯选择是否红细胞裂解；

作者: 相宜 时间: 2012-4-11 13:13

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5 {$ H2 Y7 ^# w+ w
是一种螯合剂，一般你买的胰酶里面有含EDTA的，你可以先把EDTA的基础知识复习一下

作者: 相宜 时间: 2012-4-11 13:15

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学习了

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-11 21:44

哦哦受益了，非常感谢

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-11 21:47

回复 Demon_CN 的帖子
/ {: c; `' s6 a6 f& m4 x0 P' z
我正常样MSC的时候，胰酶没有加EDTA,终止的时候就用含血清的培养基吧？怎么是胰酶呢？这个1型胶原酶也可以用培养基加血清来终止吗？

作者: Demon_CN 时间: 2012-4-12 09:59

回复 dxldeyou_2006 的帖子
6 W9 l. Z) M3 M( G
具体的好像是由于血清含有非特异性胶原酶抑制剂，就是抑制胶原酶酶消化
具体验证没做过，这样做我只是求个心理安慰！: U0 x0 a% e3 A! P% |3 F. O) p: c
这个是我个人做法！

作者: dhl 时间: 2012-4-12 10:22

胶原酶不是用来终止的，是通过多次洗涤稀释的

作者: dhl 时间: 2012-4-12 10:42

钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制，所以“用血清培养基终止胶原酶消化”这种说法应该是不对的。

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-12 21:07

回复 dhl 的帖子+ B: w# q, J" F6 g2 I; i# L8 s

哦哦，这样啊！谢了

作者: 学无止境 时间: 2012-4-14 14:32

用II型胶原酶消化行吗？

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-14 14:42

回复学无止境的帖子) }( ~! M; s( e3 h# x% G! d" ]; ?

还不清楚，不过多数文献上都是用的2型

作者: 学无止境 时间: 2012-4-14 15:00

dxldeyou_2006 发表于 2012-4-14 14:42
0 g9 M* L3 }$ ^8 I回复学无止境的帖子# L& b5 [/ i8 d4 R6 y* r! W, v5 V

4 b4 B6 g$ u j2 D$ h' \+ H* ^+ T还不清楚，不过多数文献上都是用的2型

不是，是多数文献上关于脂肪干细胞的消化都是用的I型胶原酶，我是想和有经验的老师们问一下，难道用II型胶原酶不行吗？

作者: 天枰2012 时间: 2012-4-15 10:17

DMEM还是用低糖的吧，好像高糖的容易诱导分化

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-15 10:30

回复学无止境的帖子0 g. h$ m$ i: m4 k4 {3 @
# \/ D+ y1 t! v' b5 E a7 n
哦我是想说1型的，不好意思弄错了，我也是想买1型的，保险些

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-23 13:17

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+ v# T! F" P: O/ b! i
麻烦问下，100um的滤器是100目的吗？公司卖的好多都是按目算的，我应该买多少目的？

作者: dxldeyou_2006 时间: 2012-4-23 13:19

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麻烦问一下，200um的滤网是200目的吗？公司卖的都是按目算的，我应该买多少目的？

作者: Demon_CN 时间: 2012-4-27 10:43

回复 dxldeyou_2006 的帖子0 D- A7 g( i Q7 m* |

嗯对啊# s( L+ c! x5 y& B: s
我买的BD的用的貌似是100目的

作者: lizzy_81 时间: 2012-6-3 20:18

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“成熟脂肪细胞在表层油滴下方”，成熟脂肪细胞是比水轻的？- s( a4 U. B" x/ H2 _
我想问一下，消化离心后的上层油，是脂肪细胞中释放的油滴吗？如果是脂肪细胞释放的，那是不是意味着脂肪细胞破裂了？

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