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标题: 养细胞的一些疑问 [打印本页]

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-23 09:42 标题: 养细胞的一些疑问

养了小半年细胞，对于细胞培养现在越来越多的疑惑/ @# d, @1 T/ w3 ]) a# F& X+ a, {, ]
1，细胞培养箱的温度跟二氧化碳浓度对于成纤维细胞或者其它类型细胞影响很大么？（比如，一个下午二氧化碳浓度都没达到4%，或者细胞培养箱门被人打开了一下午，忘了关） 9 w$ Y. Q, M1 m. ~
2，血清，血清对于细胞培养影响时很大的，具体有哪些呢？（我之前细胞复苏的时候，细胞贴壁，但是越长细胞越脱落，这个是血清原因么？如果是血清问题，细胞应该不会贴壁才对吧？）
3，培养箱湿度对于细胞培养影响大么？（我们之前细胞培养箱底一般都倒一些水，然后加些许无水硫酸铜，现在不加硫酸铜了，只加水感觉培养箱里面湿气很大，很闷热），细胞现在长得很慢，而且也是很多脱落的 ?, S; M% P/ c: K
4，细胞瓶里面的圆的，光亮的细胞是死细胞么？现在细胞瓶里很多这种细胞，有的人说这是正生长快贴壁的小细胞，个人估计是死的脱落的细胞，每次换液都会洗一下，但是洗了后还是有这样的一些细胞，不知道这是怎么回事3 j9 M5 P. ?3 [, h
5，血清，还有KSO等等这些的，在拿进细胞室需要用紫外照么？不照的话感觉不能消毒，可能会带进污染源，照的话，血清中蛋白又可能变性，肿么办？& e# q# S, I8 {% V+ k! g
3 ^- R; R) p" v) u, a5 }
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补充内容 (2012-4-23 09:48):
补充一点：换DMEM，对于细胞有影响么？都是高糖的，不过一个是国产的，一个是hyclone的

作者: yuhaoze 时间: 2012-4-23 10:07

困りますなあ～～
我们实验室主要是养细胞为主，尝试着逐条写写我注意到的一点儿东西哈+ C" @) Q/ j& p9 I0 w' u
1.二氧化碳培养箱即便开着门，觉得温度变化也不会太大，应该对细胞影响不大，以前做核型的时候，把细胞放保鲜里一晚上，第二天照常长。主要是pH的变化，要是楼主用板子养细胞的话，pH的变化会很大，因为开着门二氧化碳浓度会很快降低，培养液的碱性迅速变强，要是DMEM的话就会变得非常紫。这个细胞可能受不了。要是用培养瓶的话，把瓶盖子拧紧了，就不受影响。! H5 R' r+ j- ~
2.血清质量的好坏对细胞影响非常大，不同批次也不一样，我用过国产的，也用过hyclone的，国产的养细胞就是养不好。细胞状态不好，透明程度低，还有可能出现黑色的小物质，换了进口血清就好了。你说的那个问题有可能是血清的事儿。) _. Z" `+ I; g0 a. ~" l
3.湿度没关系吧，湿度高板子里的培养液还不蒸发，就是别染菌就是了。& @# h' d$ E; [' Q E; L
4.圆的光亮的细胞还可能是分裂期的，但是一般能看见两个连在一起，还有一种可能就是你这个细胞状态不好，贴壁非常慢，可以尝试着增大接种密度，在板子里面铺上一层明胶等等的。要是冲不掉，那就说明还能贴壁，不是死的。
5.血清就别照了吧，可以用针头滤器抽，但是抽到最后会很费劲，不过可以抽。- Y7 x" E$ D7 u5 l. p* _0 h2 M
6.DMEM培养上皮细胞还可以，不过这个培养液pH变化也太快了。

个人意见哈3 w- ?+ `" \4 ?" ?( R$ c3 ~4 i

作者: receiver1 时间: 2012-4-23 10:24

1.  5%的二氧化碳当然很重要。这对于模拟体内环境至关重要，有利于细胞在类似于体内的环境内生长。一下午二氧化碳没达到4%可能是因为你二氧化碳钢瓶的阀门开的太小。
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2.  血清不好的话，细胞会变老如成纤维细胞，或分化并开始死亡如干细胞，这是我养细胞的经验。你的细胞刚开始贴壁，让后越长越脱落，估计是血清不好。国产的胎牛血清，都是假的，我通过内部人士打听过，都是牛出生24h内取的血，所以应该是新生牛血清。* G% S) c! V4 V

3.  一定要100%湿度。培养箱底用大口不锈钢托盘加水，定期更换，一般每周更换。如果不是100%湿度，培养基中水分会挥发，培养基会变稠，离子浓度大，变成高渗溶液，细胞当然会死！我们有一次用活细胞工作站时，忘记了加水，结果细胞全死了！' |" A, D/ P! L
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4. 细胞在分裂时，会变圆并隆起。如果培养基内没有大量漂浮的死细胞，就不用担心。当然不同的细胞其状态不同，生长状态不好时也可能会出现你说的这种情况，这主要靠经验确定。
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5. 血清等在生产时是无菌的。你拿进细胞间时用75%酒精喷一下就可以了，当然你也可以用紫外照，没问题的，灭菌用的紫外都是UV C，不能穿透瓶子，甚至一张纸也穿不透，如果你不放心，喷酒精就行了。1 @9 t: q0 H, o, [
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我们都是用Hyclone的DMEM（高糖）。

补充内容 (2012-4-23 10:26):2 i0 O+ R6 W  n3 T
当然你拿75%酒精喷的是血清的包装瓶，呵呵，不可能直接喷到血清中。

作者: myrudy 时间: 2012-4-23 15:09

我也来回答一下：
1，细胞培养箱的温度跟二氧化碳浓度对于成纤维细胞或者其它类型细胞影响是比较大的，特别是二氧化碳的浓度，我们用的培养瓶盖子是密封的，都需要把盖子拧松一周，否则细胞的PH值会很受影响的，每次从培养箱拿细胞出来，建议观察的时间不要太长，尽快放入到培养箱内。5 k$ r2 L+ ]. \4 c, f3 R% g; `
2，血清的话，国产的血清虽然很多人也说用了没问题，但是与进口血清比较差别是非常大的，像293之类的细胞，用国产血清是没问题，但是比较娇贵的细胞，或是原代细胞，不建议用国产血清，血清的质量不好，细胞很容易衰老，形态也会变化，且增殖缓慢。6 F* h5 `9 T+ I2 n3 f, E* y/ M! L
3，培养箱湿度个人感觉要因细胞而异，我们也是记得才加，细胞状态没有特别的改变。我们通常会在钢盘里面加纯水，不加硫酸铜，因为硫酸铜会腐蚀。
4，细胞瓶里面的圆的，光亮的细胞如果是用PBS洗了之后还不掉的话，那就应该不是死细胞了，建议你每次传代更换新的培养瓶，能否消除这个现象，我们也会遇到这个情况，我觉得对细胞影响不大。 X8 H2 b# x- M) S' w5 G2 [
5，血清，还有KSO等等这些的，在拿进细胞室只要用酒精喷一下就可以了，不需要紫外照射。

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-23 16:23

回复 myrudy 的帖子0 R; g( g& w. G( m" J

4,光亮细胞很多呢？就是说这边细胞细胞在贴壁，另外一边细胞又脱落了，很郁闷啊，细胞长得很慢，跟之前没法比，之前成纤维细胞两天不到就能传一代，现在四天左右还只是80%不到。
1，就是说主要是PH对于细胞影响比较大？那影响PH的主要原因是什么呢？除了二氧化碳浓度和细胞自身生长，我们细胞长得慢，应该不会是细胞代谢导致的

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-23 16:25

回复 receiver1 的帖子* m6 _% w. T+ S# v& l! r
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4，漂浮洗吧很多怎么办呢？肉眼看培养基是看不到什么问题的，但是培养瓶一动就见很多圆的细胞，这是脱落的么？很多，大概能有贴壁细胞的20%左右，但培养基也没变黄

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-23 16:28

回复 yuhaoze 的帖子8 W. e7 `. G: L) a( y
$ Q9 }& f2 o$ ~4 G2 f9 n0 Y, E
我用T25瓶养细胞，瓶盖都是旋得很紧的，但是还是很快变紫，这是为什么呢？主要是细胞还长得不快。

作者: yuhaoze 时间: 2012-4-23 16:37

回复 huangcong1988 的帖子" V9 T: L. H8 j! M, y) B5 o" s/ `
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细胞接种量太小了，培养液加少了，也会很快变紫。细胞代谢会产生酸性物质

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-23 16:42

回复 yuhaoze 的帖子. {# E# R/ z& { V, I+ }
6 I" i# f6 D, a1 ~2 `/ a( c" i8 Q
复苏时，细胞密度也不小，但是长得慢，一直找不到原因，换了培养箱，换了血清，但是细胞一直长得慢，而且培养瓶里面很多圆的细胞，一边长，一边贴壁，一边又脱落，这让人很纠结啊

作者: b6122 时间: 2012-4-23 22:11

yuhaoze 发表于 2012-4-23 16:37
9 O, y; l0 r9 G4 c4 l0 q. I! p; B回复 huangcong1988 的帖子4 [. a( s: Z5 G% W8 O2 {) t

' r6 {9 Z1 O$ r" ~细胞接种量太小了，培养液加少了，也会很快变紫。细胞代谢会产生酸性物质

如果你的培养瓶上面没有滤膜的话，拧紧了就悲剧了。

作者: myrudy 时间: 2012-4-24 09:13

你的T25瓶盖上没有滤膜的话，瓶盖起码要拧松到可以抽动为止，只要瓶盖掉不下来。宁外，你的培养基配制的时间，建议每次配制2周内使用的量，也可能是培养基系统的缓冲能力下降。6 H' D3 ]8 @% M; x# A
你的细胞建议做个支原体检测，看是否存在支原体污染的可能性。

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-24 09:41

回复 b6122 的帖子$ Q7 h) ~8 o- Q L# H7 `' {# c

滤膜？神马东西？corning瓶里有么？

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-24 09:42

回复 myrudy 的帖子! V& `3 y* N6 R p8 c2 `

培养基我基本都是两周内用完，但是T25瓶盖有没有滤膜我不太清楚，corning的，那种橙色瓶盖的，不知道有木有

作者: b6122 时间: 2012-4-24 10:35

我印象之中，康宁有没有滤膜的T75价格都差不多。
你看看你的盖子，是不是全部都是塑料，上面没有明显的孔，如果没有的话，就是没有滤膜，你养细胞的时候就不能拧紧了，否则不通气。有滤膜的盖子一眼就能看出来，瓶盖上有孔，盖子里面反过来可以看到一个白色的膜，是0.22um的滤膜。

作者: receiver1 时间: 2012-4-24 11:57

回复 huangcong1988 的帖子
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漂浮的细胞很多说明你的培养条件不好，细胞死了才会飘起来。
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成纤维细胞是很好养的。我用的配方：高糖DMEM（Hyclone, 货号SH30022.01B，很便宜，大约50元/瓶500ml）+10%胎牛血清，1X双抗。3 ]# l7 u. z/ q/ d% Y4 j+ @2 V7 H: V, t
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如果还养不好，估计是你血清不好，或者培养箱有问题。
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补充内容 (2012-4-24 11:58):
漂浮的那些圆圆的、亮亮的都是死细胞。

作者: chentian820 时间: 2012-4-24 12:32

其实你的问题都是一些很常识性的问题，养好了，一切ok；养不好，感觉什么都有问题。; z( S( l& H1 c' A. o! Y+ ~
其实记住三条：1，良好的实验习惯，包括你同实验室的；2，细胞的种子一定要好；3不要想着省钱

作者: b6122 时间: 2012-4-24 22:53

其实我反而觉得他的问题是瓶盖的问题。我曾经用过没有滤膜的盖子，拧紧了，过两天去看，有一半的漂起来了。后来我坚决不用没有滤膜的盖子了。

作者: myrudy 时间: 2012-4-25 12:45

回复 huangcong1988 的帖子
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估计你用的是没有滤膜的，有滤膜的瓶盖很好认，你看一下康宁培养瓶的一整包的外包装，有瓶盖的不同规格。

作者: myrudy 时间: 2012-4-25 12:52

回复 huangcong1988 的帖子* a( L+ n5 R" ?' y
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[attach]41463[/attach]
上面这个图，就是有滤膜的盖子。

作者: myrudy 时间: 2012-4-25 12:56

回复 huangcong1988 的帖子' e7 F* f& s) T; B- w( c% O* m

[attach]41464[/attach]+ a) ~% @2 j3 b
这个是没有滤膜的瓶盖，很好认。这个在培养过程中，如果细胞有二氧化碳的浓度要求，那就需要拧松瓶盖。

作者: Demon_CN 时间: 2012-4-25 13:25

回复 huangcong1988 的帖子

首先，你要从冻存入手，看看你冻存液是否正确，我们一般用10%DMSO+培养基冻存细胞
然后，看你的冻存过程，有用程序降温盒，隔天再如液氮罐么？+ v- @, u5 R. W1 L9 }$ n% g" K
最后，看你的复苏实验，复苏要快速解冻，37℃1min解冻。时间不要拖太长，5 b$ d0 ?: V, Q2 w& Y' X
复苏要多洗几遍。7 F% I8 H8 I& t( b, S
要梳理一下你的实验流程中的关键点。

作者: 大少爷 时间: 2012-4-25 13:37

要100%湿度。培养箱底用大口不锈钢托盘加水，定期更换，一般每周更换。如果不是100%湿度，培养基中水分会挥发，培养基会变稠，离子浓度大，变成高渗溶液，细胞会死！
这一点我学习了

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-25 14:53

回复 myrudy 的帖子7 D- J8 L) ^. k% |: v) `

谢谢

作者: 流泪的鱼 时间: 2012-4-25 16:00

我认为你的实验细节很重要，下面的细节你注意到了吗？
      血清的处理 2 R6 G" f9 I" O( X8 [) ^( ^
　　市场上出售的血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。    ) U2 r) D5 c/ c7 {! A# ~5 {
      胎牛血清不必灭活。
　　1、将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
　　2、处理后的血清贮存于4℃。
　　3、血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。 $ W2 q! T: `8 ~6 w& p
   玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上; . b. B+ {6 K. e3 z9 }
   无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上; 2 O3 Y$ F/ p( Q" j8 D3 |1 b/ I
   培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存; ( c& c' A. K9 N8 J
   消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存;
   培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌)。至少每月一次。9 _8 w  V5 A& R, B# [
   生长培养基的配制
　　除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
   培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 7 q7 @. s6 e' |0 S
   按如下比例配制：基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL。
0 y8 c! q7 a  z! D

作者: nankou2008 时间: 2012-4-25 16:10

很多小黑点是血清的问题吗？有没有人探究过那个小黑点是什么东西？0 [5 I/ X% C. W* @
我们做的也有很多小黑点一直不知道是什么问题的

作者: 细胞海洋 时间: 2012-4-26 00:42

回复 nankou2008 的帖子1 g V8 l# W; d2 i
6 V$ W" Q5 \" J$ k# y: [5 `0 F
论坛搜索关键词黑胶虫

作者: pjlsyz 时间: 2012-5-4 09:46

回复 myrudy 的帖子: Q3 O; L: I! [* j
# i; A& ]# m* I. @% A8 A3 A
这样会不会容易污染。。？

作者: myrudy 时间: 2012-5-4 10:10

回复 pjlsyz 的帖子6 B G* a4 B' q- A+ { w
" B, z6 Z& s( g7 \& L
放心吧我们一直这么做的从来没有污染过

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