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标题: 统计一下大家做电转后几天挑克隆，G418筛选 [打印本页]

作者: zpzp0312 时间: 2012-4-23 17:50 标题: 统计一下大家做电转后几天挑克隆，G418筛选

如题
统计一下，电转后多少天挑克隆

作者: 懵懂干细胞 时间: 2012-4-23 19:13

干细胞之家有很多做电转的？

作者: genedu 时间: 2012-4-23 23:16

那的看1.神马细胞；2.神马质粒系统；3.神马培养体系；4.电转成神马细胞... ...

作者: zpzp0312 时间: 2012-4-24 08:21

回复 genedu 的帖子' [/ y6 h7 E* R# T7 R+ {

在“胎干细胞专区”发帖，当然是胚胎干细胞啊/ d+ ?% w. u* E" N' E
小鼠胚胎干细胞，C57和E14

作者: myrudy 时间: 2012-4-24 09:17

10-12d

作者: hanwei0610 时间: 2012-4-24 10:57

要看你预实验筛选的G418最佳浓度和时间。
我们实验室最短的筛选时间是7天，最长的14天.

作者: genedu 时间: 2012-4-24 15:05

回复 zpzp0312 的帖子, O4 `; C# o* @% ^3 _3 b

我的经验是，电转后第二天加G418，用药物处理5天，一周后就可以挑克隆，如果是刚做的话，就等克隆长大点儿再挑也没问题

作者: 精神病院小萝卜 时间: 2012-4-25 10:27

回复 genedu 的帖子: F1 f* R, H" X

筛选期间是正常的传代还是只换液不传代呢？

作者: zpzp0312 时间: 2012-4-25 10:39

回复精神病院小萝卜的帖子( `! Y1 ]% ]% _; t0 \& p; b" G- X# U

当然不能% y) r6 c, t f. e# [

作者: lhw7514093 时间: 2012-4-25 13:04

回复精神病院小萝卜的帖子% \/ c7 K9 i7 g# B) Z7 n( K5 R! X
2 L- Q$ G6 K# q
筛选当然是只换液不传代了，要不可能你挑的100个克隆可能只来自最初的2个克隆。

作者: lhw7514093 时间: 2012-4-25 13:08

genedu 发表于 2012-4-23 23:16
: I9 Z9 ?6 E+ x) B+ y那的看1.神马细胞；2.神马质粒系统；3.神马培养体系；4.电转成神马细胞... ...

# V& z) K. L5 i' A& y
genedu说的好，同样的细胞，体系，挑的时间也不同，完全看自己的情况，

作者: genedu 时间: 2012-4-26 00:14

回复精神病院小萝卜的帖子( y6 P+ L# @& n3 ]6 b

只换液不传代

作者: YYQ6301 时间: 2012-4-26 09:18

回复 genedu 的帖子
/ A" S0 R. b5 E F- L
你好，是否可以分享一下你电转的条件啊

作者: genedu 时间: 2012-4-26 13:13

回复 YYQ6301 的帖子9 `( Z' C! l( ^7 e( Z( U

没问题，不过我用的是LONZA的电转仪，不同的电转仪，要求的参数也不一样的

作者: cochongg 时间: 2012-4-28 22:56

14天啊，，，，而且有时还筛选不出克隆团，，，，

作者: miRNA 时间: 2012-5-29 13:40

回复 genedu 的帖子

"电转后第二天加G418，用药物处理5天，一周后就可以挑克隆"
假如这样的话，那刚开始确定最佳筛选浓度的时候，是用药物处理几天呢？ W: S, u3 [7 s6 F
不应该是处理2周，确定好最佳浓度以后，电转后再用药物处理2周吗？

谢谢！

作者: miRNA 时间: 2012-5-29 13:46

回复 genedu 的帖子$ j( k& i8 K; P. }& F

请问，您用电转以后，大致的筛选步骤是什么？) m8 M! M: w$ g j: z8 x$ p$ B. g6 v
用什么方法挑选单克隆？" w' |( {4 t* V, a% T; H9 B5 S
另外，假如药物筛选以后，再用流式细胞仪筛选，那还用得着挑选单克隆吗？, _( I8 C9 W4 t6 m$ [: E2 m- ]
+ i9 e/ y. I; k1 ~
谢谢！

作者: genedu 时间: 2012-5-29 14:14

回复 miRNA 的帖子
! ^) Y& x" V9 k) _4 d
不知道您需要诱导的细胞是什么细胞，首先应该确定药物筛选的浓度，就是利用您的成纤维细胞，做药物梯度，假如您想筛选7天，就看在7天后，那个药物浓度下，细胞死得比较干净，就选择那个药物浓度，具体需要几天根据您的实验设计而定
确定好药物浓度后，电转后先需要不加药的培养基恢复培养一天，然后再用药物处理% r" `, H: V: W, w5 Z
挑取克隆也是根据您的诱导的细胞而定，举个例子，假如您是诱导的小鼠iPS细胞，就把克隆球划下来，胰酶消化，吹打，中和加到培养基中即可
关于流式细胞仪筛选，我的建议是，先挑取克隆后，再用流式筛选，那样效果会更好- ?# N$ p8 s7 `; X* p1 k
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作者: miRNA 时间: 2012-5-29 14:34

回复 genedu 的帖子; k- ]0 u2 Y% o& t7 x6 O8 V) B0 ]

如果按照您的说法，筛选几天都是需要实验设计而定的话，那肯定筛选时间越短越好喽，节省时间嘛，可是电转一天后，加药物处理，一般都得10-14天吧，那之前确定药物筛选浓度不也得至少10-14天吗？
1 D) {3 t; s) [, o+ |1 }
另外问一句题外话，您知道是否有人在质粒的SV40 promoter-NeoR的后面加上IRES-EGFP吗？因为质粒本身没有带GFP，可是由于各种原因，插入的目的片段后面也加不了ires-egfp，那利用新霉素的启动子SV40来启动EGFP的表达，这样可以吗？
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谢谢！

作者: genedu 时间: 2012-5-29 20:33

回复 miRNA 的帖子

筛选的时间并非越少越好，时间短必须得使药物量加大，这样会使细胞遭受很大的损伤，一般的文献报道在7-14d之间，不过每个实验室也有所不同，我在筛选时偏重于药量比较大，一般5d，我感觉这已经是极限了，不能再少。
关于SV40 promoter-NeoR-IRES-EGFP我没做过，不敢乱说

作者: genedu 时间: 2012-7-6 20:23

回复精神病院小萝卜的帖子. n9 m; f7 {( n5 m6 I$ d; s
0 U* B1 x, F1 a3 J$ ~
只换液不传代

作者: lsjj619 时间: 2012-7-10 14:46

回复 zpzp0312 的帖子! v% H. y) v5 }/ H# O8 Z$ U
. j' @+ {# a8 h2 q8 U# c' m8 I, ]
请问，你做的小鼠胚胎干细胞德尔电转效率及电转参数设置？

作者: tyss 时间: 2012-7-11 09:07

我们一般是7天，如果7天后克隆较小的话，就再多培养几天

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