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标题: NK细胞越来越少 [打印本页]

作者: kedele 时间: 2012-4-25 10:53 标题: NK细胞越来越少

本帖最后由 kedele 于 2012-4-25 11:14 编辑 6 `+ \; F% B, D' k
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大家好！我做的是NK细胞。用NK细胞分离液试剂盒从脐血中分离出来。然后做流式检测CD3-CD56+的含量。分离的最好的只有30%左右。用脐血直接检测出来的CD3-CD56+是10%左右。然后用的培养基是VIVO-15+IL2(100万单位/L)+IL12(5μg/L)+双抗（1%，2万单位），接种密度是1×10^6/ml。用T25瓶培养。第二天吸出悬浮细胞，弃贴壁细胞。细胞密度无明显下降。培养5天后，细胞数量明显下降，流式检测CD3-CD56+含量也降低。希望大家能帮忙提出一些建议和意见。谢谢大家！以下是我的实验数据和相关图片：

作者: 笨笨的图图 时间: 2012-4-25 13:17

看你的图，发现以下几点：背景很高，死细胞很多。建议使用三标抗体：CD3/CD16+56/CD45，用CD45圈门,结果会更好看滴~~

作者: kedele 时间: 2012-4-25 13:19

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谢谢了！我们的流式都是有专人做的，我参与不进去。请问背景很高是什么意思？我想要解决的是死细胞太多的问题。谢谢！

作者: 笨笨的图图 时间: 2012-4-25 13:26

死细胞多是你培养的问题，现有条件的改进上就是加一个CD45,据我所知，NK的培养很难，尤其是培养基的选择，你再看看吧~

作者: kedele 时间: 2012-4-25 13:27

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好，谢谢了！

作者: zuming 时间: 2012-4-25 15:38

无血清培养确实不好养，如果没有特别的要求，还是用加血清的培养体系吧，会容易一些。

作者: kedele 时间: 2012-4-25 15:52

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我们本来做了三个对照，其中加10%的1640培养基效果没有这个好，所以就用这个了

作者: jack063@163.com 时间: 2012-4-26 13:54

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你好，我目前也是培养NK细胞的，仔细看你的图片后有几点小的建议，大家互相学习：9 u6 G) m! ^+ K
1.“第二天吸出悬浮细胞，弃贴壁细胞。”楼主是都考虑下这个天数上的操作是否太绝对了，我们目前要看细胞的数量、形态、培养基颜色判定是否进行这部操作，细胞就像一个个的“宠物”不是生产流水线步步严格SOP操作。
2.不加血清的培养基，生长的时间长是很难的，楼主可以考虑适当补加血清试试，我们加了血清的可以培养到10-14天。

作者: kedele 时间: 2012-4-27 08:46

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好的，谢谢了！

作者: LL87 时间: 2012-8-20 22:05

弱阳性

作者: 星夜倩儿 时间: 2012-10-16 15:47

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你好，想问一下，你的NK细胞是用什么方法分离的？我用的Percoll，分离的效果不太好，希望指点一下，谢谢了！

作者: 大海之家 时间: 2014-2-26 14:38

回复 jack063@163.com 的帖子7 J9 v; }) I% K+ K v% V) e0 w
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请问你们培养的数量和表型能够达到多少？培养基是专用的NK培养基吗？

作者: chenlin080102 时间: 2015-4-15 13:46

这种方法养的贴壁的那部分其实是很纯的NK细胞，我做过这个流式检测，不过我还没找到办法怎样让那部分NK细胞不贴壁

作者: chenlin080102 时间: 2015-4-29 13:39

配方有问题，缺乏足够的刺激剂

作者: 小梓莜 时间: 2015-5-7 16:51

回复 kedele 的帖子9 v2 b* s* n, G/ x* M+ x8 k) I
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你好！我有个弱弱的问题，如何上传图片？麻烦你了

作者: 细胞海洋 时间: 2015-5-8 20:26

回复小梓莜的帖子. A" v2 T8 B% J
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发帖或者回复高级模式附件上传单个图片不要大于1000kb

作者: gengtongyu521 时间: 2015-5-13 08:44

建议（1）分离细胞时，收集自体血浆，56度灭活，作为血清使用。
（2）培养前期可以用微量的CD3单抗来刺激，这样扩增效果可能会更好。+ [# P# ?/ g7 [, N, R/ M8 B @) v

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