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标题: 核型分析求助 [打印本页]

作者: huangcong1988 时间: 2012-4-25 12:36 标题: 核型分析求助

昨天做了一次核型分析，基本步骤是：% G3 k/ {' }2 W1 |$ ]9 ?
1.秋水仙素，终浓度0.1μg每ml，处理4个小时# L* ~8 A: u7 A( \8 B
2.吹起细胞，离心，弃上清! _0 c& M% Y3 H: y5 I9 i/ ]
3.加入5ml 0.075M的氯化钾，37°，20min' Y. O3 c9 N! A6 ]7 \+ o
4.加固定液1ml，离心，弃上清
5.再加固定液5ml，静置20min，离心，弃上清
6.重复步骤5( T4 K' |9 |% R9 i7 p: s
7.再加固定液1ml，将细胞悬浮
8。从﹣20取出预冷载玻片，于20cm高度滴两滴细胞悬液在玻片上，过火数次，干燥+ S3 T2 W$ F1 \9 t/ N R
9.giemsa染色，10min
10.二甲苯浸载玻片，晾干' ^3 R, Q% g4 q1 Y! c
11，镜检

几个问题：! |/ \' @! d; }: q2 Q
1.第七步的细胞悬液要在﹣20里面保存备用吗？会结冰么？结冰怎么融？常温或者四度放置不行么？能放多久
2.二甲苯浸漂的作用是什么？二甲苯什么功能？5 r: R1 J/ @* U3 d) ~. c/ `
3.制好的片子能不能直接显微镜看，有的人说需要静置老化处理
4.40×的为什么不能看清，我看了一下，看不出效果，一定要100倍油镜么？

作者: myrudy 时间: 2012-4-25 13:01

4度是可以存放，-20度是不会结冰。

作者: ontheway_hit 时间: 2012-4-25 13:26

1.第七步的细胞悬液室温就可以，为什么要放在﹣20呢。我做的时候就是室温。资料里也没有说要低温的。
2.二甲苯是使细胞透明度提高，具体我也不清楚。. W* O# t2 k* y, y/ G' l4 k
3.可以直接看
4.100倍油镜效果好。

作者: YYQ6301 时间: 2012-4-26 09:09

回复 huangcong1988 的帖子5 D- f% q0 E: [3 {0 K# ?9 `
$ E: `- R" j0 f% l* E; J; q' [
1、固定好的细胞可以放在4°C长期保存，没有必要放在-20°C: X ~! F" ]* f9 h! w/ R/ x; i6 m5 K
2、二甲苯浸泡可以增加细胞的透明度0 [2 ]! o' b# ]5 t/ ^$ V( V/ q
3、片子是可以直接看的，老化是为了显带
4、100倍的油镜可以观察清晰

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-13 11:10

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用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-13 11:11

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用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

作者: YYQ6301 时间: 2012-5-14 16:52

我们都是胰酶消化后离心，整个过程离心都能看到沉淀的，你的会不会是低渗作用时间太长了呢

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-15 16:50

回复 ontheway_hit 的帖子0 }& o, a/ J7 v; a& j5 l

还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-15 16:50

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还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

作者: ontheway_hit 时间: 2012-5-16 14:37

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称取10mg秋水仙素，溶解于100ml生理盐水中，即为100μlg/ml，过滤除菌，分装到1.5mlEP管，-20度保存。一般的介绍里就是这么配的。你一次把1g秋水仙素都用了，是不是太浪费了？估计没人会这么配的。

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-17 08:52

回复 ontheway_hit 的帖子+ g" D. z% [! L/ @& w/ i: k
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秋水仙素要冻存？我一直放常温啊，放了快一年，不是吧？

作者: ontheway_hit 时间: 2012-5-17 12:09

我见书上是这么说的，那你一直放常温影响实验吗？还有你分装了吗？常温是不是容易长菌啊？

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-17 21:52

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( A) k5 d2 S/ k" O( N, {
没有啊，秋水仙素也有毒，个人觉得常温放着没事。我还有一个问题就是，过火的时候，是直接正面对着火焰还是背面呢？我今天又做了一次，效果还是不理想，这次做基本看到沉淀了，但是制片后没有看到分裂相，不知道什么原因，请指教

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