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标题: 请教各位人外周血NK细胞分离培养应用于临床流程及加些什么因子？加多少？ [打印本页]

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-4-26 16:20     标题: 请教各位人外周血NK细胞分离培养应用于临床流程及加些什么因子？加多少？

我从事动物细胞培养几年了，现接触到了NK免疫细胞，我们目前只是简单的淋巴细胞分离液密度梯度离心---细胞刺激因子包被好的t25瓶子5天左右---t75瓶子2天左右---CO2bag5左右--收获制剂。培养基用的日本进口产品因子是加好的.如果有人做这行业请发表一下你们的流程和所加因子。

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-4-26 16:22

感谢大家的关注！

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作者: lunyuyuanxj    时间: 2012-4-26 18:10

你包被的是什么种类刺激因子呢？效果如何，最后NK细胞比例、扩增倍数一般能达到多少？5 y" S* N2 w" J
据了解一般如IL-12、15、18等单独或联合刺激对NK细胞培养均效果不是很好，扩增倍数较低。/ R, f5 j4 i3 a0 @
国外研究多应用额外的刺激因素，如K562细胞经基因改造细胞膜外表达IL-15等，报道取得的效果较好，但国内一般的医院无法实现该目的。

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作者: andylee824    时间: 2012-4-27 10:55

看到一个非常好的培养NK的方案，此文是2011年年底发表的文章，应该是最优化的方案。链接：http://www.jove.com/video/2540/e ... eral-blood-nk-cells
* p% T2 L/ v/ t- K8 ]" c) J
% J* c/ B0 b6 R2 g& B（1）分离方案是 RosetteSep purification protocol 或者直接用PBMCs 。! x5 ~( j8 V" i
（2）细胞因子用 IL-2.0 }8 K6 o/ t8 t5 m
（3）饲养层细胞是 K562 Cl9 mIL21 ， 该饲养层细胞上嵌合 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15) （4）扩增效率可以达到“21,000-fold expansion in 21 days”。5 A% d( t- b2 e, `5 i1 g) b# r+ K
（5）培养基用的是 NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)，文中有配方。

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作者: andylee824    时间: 2012-4-27 10:59

  作者单位是Division of Pediatrics, MD Anderson Cancer Center - University of Texas。有PDF的文献，也有video的讲解。其中他用到的饲养层细胞 K562 Cl9 mIL21 ，在下面的跟帖中有人提到了可否获取，他回应说 “该细胞系已经在US 以及国外分享，可以和他电邮联系”。我跟他联系后，他说可以给，但是海关那边有点问题，就搁浅了。不知道国内有谁用过这个饲养层细胞吗，我一直在寻找

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作者: lunyuyuanxj    时间: 2012-4-27 18:42

回复 andylee824 的帖子  P/ y9 n5 z3 C* {& B
' |$ Z! ]# Y( T# J7 A- @( {0 d$ f7 M
这篇文献我也看了，有两点感受：
) e. q  q; X4 ]! t1、至少在我处的这个条件下，做不出这种细胞；$ Y) R( J4 l, I/ ~, [4 A
2、整个过程太过于复杂繁琐；
/ R/ i% }$ L% Z( E; W; `; j' n3、如果经改造过的K562细胞未完全消除是否会对人体有伤害。

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作者: zuming    时间: 2012-4-28 10:28

回复 jack063@163.com 的帖子  I6 _9 ?( j! {

2 C- y% }" f5 H0 J9 W4 U! h我也用过日本的这套产品，其实扩增结果还是不错的。但是nk的纯度好像不够好。

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-4-28 11:13

我们目前还是用的日本全套技术，扩增效果确实不错14天左右能达到109，不过确实像你在最后收获的时候纯度不够好。% b1 n4 K1 N& R+ f- k! x
日本鬼子说了几点：
4 G! _; N* L3 C8 w$ F" L1.由于采集的是患者的外周血所以每个人的疾病史或许是不一样的，比如有些经过化疗的病人就会有异同，还有一些乙肝患者免疫细胞生长就会相对快些。
: J% E' b9 ]0 c2 }8 h2.这个跟我们操作时传代的时机有关系和细胞生长多少，生长到什么状态阶段去传代这个是个经验活很难文字描述的清楚，具体问题具体分析吧。2 S6 o  a) o1 g6 U

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-4-28 11:34

除了IL-2第二次加的是第一次的10倍外，我们还没得到任何信息，包被液也不告送我们是什么 150wRMB的技术转让费啊换回来一堆培养基。

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-4-28 11:34

哪天要是培养基断货了我们这实验室就得散伙了

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作者: zuming    时间: 2012-4-28 12:10

回复 jack063@163.com 的帖子
1 U8 {3 {0 D! _9 u& M( `1 ^4 t" @6 G' C' S) |
花了那么多钱居然不告诉你们具体试剂，晕！可恶的小日本啊！

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作者: zuming    时间: 2012-4-28 12:12

回复 jack063@163.com 的帖子
. ~: E, F+ K* D& m% M0 X) S7 Z: |% E6 G; S
其实很多国外文献中都有介绍具体步骤，我们也在自己摸索一些方法，但是效果好像真不如小日本的。

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-5-4 08:50

还有没有分离培养NK细胞的：
: V. M2 R  X6 Q" n1. 大家一起来讨论下你的技术来自哪里？ 我们应用的是日本小田医院的全套试剂技术NK DC CIK。还有韩国莗医院的神经干细胞。
5 w/ N" p% W8 B* l/ t  I! }2.你们有谁是应用的国内转让的技术，加的因子养的顺利么？
$ L8 B9 @# x; j  z3 [8 O3.你们的实验室是应用于临床的么？做细胞注射液的时候收获的细胞达到什么数量级（109）一次给患者输注多多细胞，多久输一次，加其他的保护液么？
. w% s6 G9 d' ~1 Q
* l7 I5 E, ?: p5 L- ]9 Q

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-5-4 08:50

楼主自己顶一下

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-5-4 08:52

希望大家常来NK板块，做NK细胞的大家互相交流分享成果。
+ U* i9 j8 b( _( u; f你有一个苹果，我有一个苹果，我们交换还是一个苹果，你有一个思想，我有一个思想，他有一个思想我们交换

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-5-4 08:53

希望和大家成为朋友

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作者: 冠忠    时间: 2012-5-6 18:00

楼上师兄，我有跟小田医生见过面，我们最后没有跟他们合作，都是自己做CIK研究。但我觉得小田医生很好，请问你在那一单位工作?大家可以交流一下。谢谢^^

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作者: jack063@163.com    时间: 2012-5-7 08:45

回复 冠忠 的帖子& M. c' H1 R0 U, _

! l# L3 z& s9 X: J3 Z* J- b4 G! L原来和天士力合作失败，目前就职于天狮集团

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作者: cochongg    时间: 2012-5-7 09:03

有一间叫宏洋的公司好像是专门做nk细胞的，而且技术还挺成熟

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作者: aoppolle    时间: 2012-5-7 14:41

NK细胞这么难吗

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作者: hwlightning    时间: 2012-5-23 15:00

回复 jack063@163.com 的帖子
8 j; X8 c8 t+ `5 L1 v/ n2 F! p
' i+ ?2 h1 [+ j请问为什么乙肝病人的细胞会生长快些啊？5 c# M  J8 K: L3 ?
还有NK现在有没有全由因子诱导培养的啊~~~~不用饲养细胞。

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作者: hwlightning    时间: 2012-5-23 15:03

我最近用培养cik的方法养出来的CD3-和CD56+有20%左右。
% O( }# S) N) B8 f# Q. P& |+ ]. v想看能不能重复出来，让其稳定。

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作者: jianglei_sd    时间: 2012-7-27 14:47

即将上项目，学习一下

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作者: _然然    时间: 2012-11-22 09:37

要进行NK的培养，目前正在搜集资料阶段，请问各位前辈都用什么方法呀？  nk很难养吗？   日本做nk比较成熟是吗？  现在看文献 有单用细胞因子的也有联合饲养细胞的 谢谢

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-11-22 10:09

回复 _然然 的帖子) p$ V( h! p, Z' X3 d, u# a

/ j, X4 z/ e) C1 r, m- H% }建议你发新帖提问

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作者: _然然    时间: 2012-11-22 10:12

回复 细胞海洋 的帖子" l  R* _( p1 ?! E, k- S3 o0 V  R; X% G

/ }! q9 {% I% m* O3 S( ~$ B好的

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作者: stang198651    时间: 2012-11-22 14:53

回复 jack063@163.com 的帖子
7 D/ o% d; ]) P
& ]% v8 Y: r+ {4 }  P! h* a你们用的日本全套技术抽病人多少毫升血液？

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作者: hwlightning    时间: 2012-11-27 09:55

回复 jack063@163.com 的帖子! v% w% ?; }' k" m; y

) L4 f$ `/ X% b1 F) h' |; S师兄，你们的NK养出来纯度和数量是多少啊？
2 Z% a' C4 o  Y8 n- k" I

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作者: _然然    时间: 2012-11-28 15:55

回复 jack063@163.com 的帖子
; v! J, T2 G+ W- q5 d
" o1 u. [  o& \你们目前做的nk 直接是pbmc加因子诱导是吗 看好多文献是加饲养层细胞

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作者: mtdj1314    时间: 2014-1-14 16:08

你们从日本购买的试剂盒需要多少血标本？还需要购买饲养层细胞吗，楼上几位的问题我也想知道答案

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作者: 大海之家    时间: 2014-1-21 10:14

小弟我现在也准备研究NK细胞，在广州有些台资企业做NK，好像也是用日本的技术，不知道大家还有没有其他方法可以诱导出高数量和表现的NK细胞？给点建议吧，培养基用的的品牌，用哪些因子，具体的方法，，，

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作者: 大海之家    时间: 2014-1-24 09:56

回复 jack063@163.com 的帖子
8 F4 L# ^% C& j" T- e4 d3 `) I" h+ L+ y$ E. F' l1 r6 c& h9 T
时间都隔了这么久，不知道你解决了困扰你的问题？是日本方面卖给你们包被液你们自己包被还是你们买了包被好的瓶子？NK细胞能获得多少比例？

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作者: cantonchn    时间: 2014-1-24 11:12     标题: RE: 你们用的日本全套技术抽病人多少毫升血液？

回复 stang198651 的帖子$ @0 X( x# m& X# p$ m
/ I, [5 T- R, g5 \. n, W" W
40ml左右，按两次输注量培养。也就是抽一回二。

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作者: 大海之家    时间: 2014-1-27 10:09

回复 cantonchn 的帖子
/ V+ `  [" @/ u% y% e& q( e# b& {3 c
回输的数量能达到109次方吗，CD3-CD56+的表型能达到多少？

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作者: cantonchn    时间: 2014-2-8 08:58

回复 大海之家 的帖子
7 i3 ^# x6 b3 F2 {- A/ p  F, W! V, S' C& E# J
数量远不止~~~

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作者: 大海之家    时间: 2014-2-24 09:18

回复 cantonchn 的帖子
9 ]9 a2 m0 k8 L! C
6 v9 d" t; s# C) d# r可以达到1010次方吗，一次回输？是不是用饲养层刺激的？还是用特殊因子刺激的？据您所知，包被方法可以用来诱导NK吗？
! `4 E1 i9 W, A& d$ |

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作者: cantonchn    时间: 2014-2-25 09:17


, g& i$ o( C  m4 L% ^5 q
0 k6 c% }  y) [* y2 e回复 大海之家 的帖子
; L" E  Y1 u, c! z- [2 z+ u& n& _0 d
一般20个亿/次，不可能100亿。
! V; `/ t2 r0 }培养方法日本技术较为独特，无法抄袭。

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作者: 大海之家    时间: 2014-2-26 13:55

回复 cantonchn 的帖子
& i, B! I3 b+ [0 z- n
# i, I: m6 f" |, j8 L* a有没有相关NK培养试剂的销售或者技术转让服务？

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作者: xingyanchao    时间: 2014-12-30 18:29

回复 jack063@163.com 的帖子1 p' s( P8 D, b; Q+ r, S
  z9 O3 K' f9 `/ a9 L
日本的全套产品是哪个公司在做？
/ s1 P+ F' R+ [; Y. O8 d

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作者: 流泪的鱼    时间: 2015-2-26 23:12

回复 jack063@163.com 的帖子- @# Q. T, G& M; R
  y4 I- P1 e- K, H9 ?# L
朋友，你好！我转让NK细胞的培养技术。你还在那家公司吗？

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作者: 流泪的鱼    时间: 2015-2-26 23:13

回复 jack063@163.com 的帖子
  u, Y  h; M- X1 l
& S4 k% y& I8 G: [; I您还在天狮集团吗？

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作者: 流泪的鱼    时间: 2015-2-26 23:14

回复 大海之家 的帖子% i1 t. Y1 F7 }. y9 a4 D7 b

+ B4 W4 a" _8 X9 W8 B6 G' H7 b朋友，你们公司培养NK细胞怎么样了？我做了NK很多年，技术已经成熟。咱们可以技术转让，也可以合作。

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作者: 维维睡啦    时间: 2015-2-27 08:59

你用的是日本宝日医的试剂盒培养方法么，因子用的白介素2，包被液也是现成的，我曾经也做过，培养结果不佳，细胞亚群分析也不是很好，而且培养有一定的失败风险，技术上其实不是很好。我们现在用另外的方法~

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作者: chenlin080102    时间: 2015-4-29 13:50

单纯的用白介素类的因子刺激是不够的，缺乏理想的刺激佐剂是很难持续扩增的，我们现在用外周血培养，不含滋养细胞，达到17天增殖120倍，纯度70%

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作者: 飞翔的烨    时间: 2016-1-16 16:42

回复 chenlin080102 的帖子. j/ g2 T7 A# o5 [

3 U8 a0 {$ c. W# O! S3 Z, L可以给点参考意见吗？

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作者: 魏夏媛    时间: 2016-4-8 17:16

纯因子的方法不清楚，我用滋养细胞刺激每次只加因子IL-2

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作者: 吕小松    时间: 2016-4-20 12:49

回复 魏夏媛 的帖子
9 P, v- Q1 n! Z  R2 A" L
+ g4 X8 X! o" A4 a6 M% N0 d这样培养的话，NK的纯度和数量怎么样？

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作者: ybql    时间: 2016-4-20 16:51

用饲养层的话，饲养层不清除干净会有潜在风险，因为不知道饲养层细胞带有的分子信号，进入体内后会发生什么

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作者: 魏夏媛    时间: 2016-4-26 10:01

回复 ybql 的帖子
. M3 w6 }' o$ l
+ u3 R6 D: {: U3 p. O3 v3 Y谢谢

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