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标题: 今天丝裂霉素处理MEF出现了问题，谁能告诉我啊 [打印本页]

作者: chenchunlei 时间: 2012-4-30 22:07 标题: 今天丝裂霉素处理MEF出现了问题，谁能告诉我啊

丝裂霉素处理MEF2.5小时候，用PBS洗了5遍后加了1.5ml胰酶消化液，但消化下来的细胞成胶冻样，怎么回事？之前没有过啊6 R9 q. t( P ?$ k) C9 Q

作者: 懵懂干细胞 时间: 2012-4-30 22:22

是不是消化过头了？细胞质黏稠物质流出来了吧

作者: 细胞海洋 时间: 2012-4-30 22:31

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建议上图

作者: chenchunlei 时间: 2012-4-30 23:12

回复细胞海洋的帖子- [. Z' B% x4 q' S
/ d+ u0 o \) `' L. u: r
我一看不行，就给扔了，接着又处理一板，今晚又得奋战12点啊，苦逼！过会看看行不行，不行必须上图求高人

作者: cochongg 时间: 2012-5-1 01:27

这粘稠与MMc没有太大关系，应该是因为过多细胞死亡，胞浆，最要是细胞核，还有一些酶的作用（DNA酶、RNA酶）使其粘度加大。) w1 B8 e7 s" R" p5 m# k$ H8 ]
建议：镜检
具体需要镜检观察才好判断，
如果离心后不粘稠，传到瓶子后粘稠的话，那好办，建议你离心后，重悬，置于4-8℃冰箱5-15min

作者: zhusealin 时间: 2012-5-1 07:23

可能是胰酶消化过度了吧，消化下来的细胞镜检一下，看看是不是都成细胞碎片了

作者: yuanyan2010 时间: 2012-5-1 09:20

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洗5遍这么多啊。我们都只洗2-3遍的。。。没必要洗这么多吧。。。

作者: momocy 时间: 2012-5-1 12:08

我们是洗3遍的，估计是你洗的久了，消化久了，因为粘稠可能是细胞破了，里面的genomic DNA出来了，所以粘稠。话说，我有个疑问，丝裂霉素处理后一定要洗3遍吗？如果只洗一遍行不行，有人试过么？

作者: 抹了个茶 时间: 2012-5-1 20:39

回复 yuanyan2010 的帖子2 W$ ?0 c- c1 {/ B& e

我都不洗的没那么多pbs 而且我们都不用一次性的移液管否则太浪费了

作者: 抹了个茶 时间: 2012-5-1 20:39

开个玩笑。。

作者: frankieisme 时间: 2012-5-1 22:27

本帖最后由 frankieisme 于 2012-5-1 22:28 编辑 ) f; v0 R$ _: x: U% a8 q
( ?( R% D0 W+ b+ u z) M; ?
PBS洗3次,加胰酶消化,镜下观察大细胞间隙出现,细胞稍稍变圆就终止消化,计数种板.为什么不按标准的protocol做,一般情况下还是不需要随意更改protocol.

作者: zhusealin 时间: 2012-5-2 07:28

我们也是处理完洗5遍，细胞也挺正常的。主要应该还是消化的问题

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-2 08:30

回复 chenchunlei 的帖子! O- a& z' A- e

1.5ml
胰酶？1.5ml是不是多了点？个人觉得你量的三分之一就够了，胰酶哪有用那么多的啊？

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-2 08:31

我试过用洗两次，就洗两次，效果也行，不过洗5次可能还是多了点

作者: receiver1 时间: 2012-5-2 08:48

MMC处理的时间是合适的，PBS洗几遍都没多大问题。问题肯定出在你的胰酶消化这一步上！

作者: myrudy 时间: 2012-5-2 09:01

回复 momocy 的帖子+ t( q1 y6 L/ m( a$ a; z
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洗一遍的话，丝裂霉素的残留量会较多，对细胞伤害较大。

作者: YYQ6301 时间: 2012-5-2 09:04

丝裂霉素的浓度没有弄错吧？应该是消化过度了

作者: shangchunhua 时间: 2012-5-2 09:54

回复 chenchunlei 的帖子
1 {4 Z0 d1 R- }
PBS是预热的吗？

作者: chenchunlei 时间: 2012-5-2 21:39

操作版本怎么这么多啊

作者: 前途似锦 时间: 2012-5-3 08:29

回复抹了个茶的帖子

这。。。。。。。。不要误导小朋友啊，呵呵

作者: scienese 时间: 2012-5-3 08:37

楼主这样的问题我也遇到过，就是一些酶联反应造成的，你那枪头往细胞表面一粘，都能扯出丝来，很好玩的呵呵。。。这种情况我就放弃了，细胞是很难消化下来的，及时消化下来它也不长!

作者: chenchunlei 时间: 2012-5-3 17:34

回复 shangchunhua 的帖子7 C5 s3 W6 ~1 }$ t' \9 E
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我们从来不预热啊

作者: shangchunhua 时间: 2012-5-6 09:56

回复 chenchunlei 的帖子! n9 }# Z& V5 U( K& r

我都是用预热的PBS洗MEF的，效果很好！我以前也用用过不预热的，发现细胞很容易被洗的脱落下来，获得的细胞量少。建议楼主还是预热吧，洗的时候也轻一些，不要对着细胞。

作者: 184lj 时间: 2012-5-10 00:18

0.05% T/E溶液，3min就可以了，浓度不用太大。

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