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标题: 细胞污染问题 [打印本页]

作者: hyf198675 时间: 2012-5-2 18:58 标题: 细胞污染问题

我培养的事脐带间充质干细胞，第20天时被污染了，各位能不能帮我分析分析原因啊？我是第一次培养细胞，而且没人指导，全是自己摸索，所以没有头绪！

作者: 细胞海洋 时间: 2012-5-2 19:06

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污染的原因很多种，说清楚你的试验方法，步骤，还有图片

作者: cochongg 时间: 2012-5-2 19:41

这个嘛，污染不要紧，重要的是那句“留得青山在不愁没柴烧”，，，你都养到第二十了，有冻存吗？？？？
建议：在细胞状态好代数低的时候适当保种，这样随时都有健康的细胞加入到你的实验工作中
但是原代污染了，，就麻烦，特别是支原体污染，刚开始看不出，时间长了细胞就不行了。
建议冻存后一两天，取一管细胞复苏，检验一下有无污染（培养法），支原体还可以用PCR法鉴定

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希望对你有帮助

作者: daviddow 时间: 2012-5-2 20:43

主要是试剂和操作，建议看看细胞培养之类的视频

作者: jack063@163.com 时间: 2012-5-2 21:30

养细胞就像养孩子，甚至比养孩子还难。

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1.首先要排除培养液的问题，配制培养液后一定要做无菌试验，过滤时要注意滤膜本身及其安装是否有问题；购置的使用后最好也测试下，
2.其次，要排除培养液保存问题，比如，瓶盖有裂隙或者是盖子与瓶口不合，密闭性差，容易细菌污染。还有就是操作过程中出了问题，不注意无菌操作，消毒不严格，造成培养液的污染。超净工作台、手的消毒，拿培养瓶时不要拿盖子及其周围，培养液开盖后要斜着放，瓶盖横放，盖口不要向上或向下，培养瓶等尽量放在工作台的中间等等。
3.总之，关键是无菌及无菌操作，无菌操作是个人习惯找个人给你监督一下你操作中的定性习惯不对的地方有目的性的改进，做到这两点应该不会出什么差错了。

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作者: jack063@163.com 时间: 2012-5-2 21:35

无图无真相，楼主最好发张图片上来

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细胞的细菌、真菌污染及排除" f. L( s8 l" W
Edit By Waiting.D
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

真菌污染, S  G! X) P# u! u
细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（μm）计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。+ }/ N) f7 t  t8 r. z5 C
+ c, ?" x& Y) [$ I/ Z6 `

细菌污染# u- N4 C1 c5 C' ]# T6 C4 N
细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多再发生污染48h以内就已明显。在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有利于及时采取措施予以补救或排除。5 H! E6 h- m8 q' b1 e" D+ p# _/ V
培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理)（具体操作方法可参考细胞培养污染的预防），复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采用5～10倍于常用量的抗生素冲击，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养液，有时可能奏效。细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。
常用抗生素用量和效应
抗生素抗菌谱浓度（量/mL）* D" t9 y5 D% n% S, m/ J7 w
细菌真菌支原体   s9 ^1 v2 F) K) l; s
青霉素 G+           100～1000u
链霉素 G-           100～1000μg8 D) E# Y2 I% V# }2 T
庆大霉素 G+ /G-      + 50～200μg
四环素 G+ /G-      + 10～50μg
卡那霉素 G+ /G-      + 100～1000μg
两性霉素      +      常用2μg/mL1 O/ s" w4 U9 Q% X0 t  f8 K5 K* A* P
制霉菌素      +      常用25μg/mL/ X3 z) s. r; o" l* }
+表示效应程度4 G/ P/ ?! u! w( ]- h
  S" Z4 V9 s; S/ }; w% |5 D
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。3 d( H1 s3 f' t/ B/ I/ V. {
1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。& N8 r1 ~! {  [9 r1 X
5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。# y6 Z* C1 S4 d
6.重复步骤4。
7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。# T( V1 K# |2 m" ~# ~

作者: jack063@163.com 时间: 2012-5-2 21:37

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作者: jack063@163.com 时间: 2012-5-2 21:38

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作者: jack063@163.com 时间: 2012-5-2 21:39

养成良好的无菌操作的习惯拿70％酒精擦手，擦超净台，擦培养瓶，擦培养基瓶，各种瓶子的口多拿火焰烧灼。就不再会发生细菌污染。% }2 z1 t6 [! K! u6 F5 e4 h# s
决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要求自己遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好，越“罗嗦”越好！
我发现在提取需要组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）6 j6 D6 b! Z' y5 ^# T+ b* s
另外，每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面，不消毒的器械（如移液枪，冰块等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处进行；使用无菌台后，再用酒精擦全台面，紫外照20分！
还有，做到绝对无菌，那不可能！但我们可以做到最大限度的减少含菌量！
使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
1. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
2.凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
3.初学者一般可以用培养瓶养细胞，个人认为瓶污染的机率要比皿小。
4.注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。0 V, R2 C% O+ u& @+ W7 E
2. 1.注意喷酒精装置的应用：制作很简单，用过的化妆品，理发店理发前往头发上喷水的瓶子及其他一些有喷水功能的瓶子，经过处理装上百分之75的酒精就可以了（我不知道有没有实验专用喷洒酒精的瓶子，如果有那就更好了）。我用的是师姐留下来的一种护肤品的瓶子。常常往超净台台面，手上喷洒酒精，效果很好。

2。我进入细胞培养室就戴上PE手套（一次性塑料薄膜手套），当在超净台操作时戴上一次性橡胶手套。  Z# N  o- v9 I; j' p* R
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3。培养箱内水盘里的水，用灭菌的超净水，每周更换一次（至少也要两周换一次）。换水前要用百分之75酒精消毒。水浴箱也要定期消毒（用百分之75酒精）换双蒸水。5 P! `$ ^  n; c* Y* j) d

4。从培养箱内取东西前手一定要喷酒精，动作要快，可以先看好了，要取的东西在那里，然后快取。显微镜下观看细胞时间也不要过久，否则会对细胞有不利影响。

5。很多人喜欢常规用抗生素，其实除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

6。液体培养基贮存于4℃ 冰箱，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。温热前后注意酒精消毒。' Y( G) i5 Z( D' g  l8 e) x$ }  r

7。用离心法从动物身上取细胞时，其离心速率不要超过1000转/分钟（很多文献上都大于这个数值，但记住不要超过1000），时间一般不超过10分钟，否则会造成细胞死亡。9 O+ p- u! U- S$ f: N

8。取出冷冻管后，一般是放入37 °C 水槽中快速解冻。我按着师姐的经验都是放入38°C的水中，上面一些战友提到了39和40°C，不知道效果如何，希望多多交流，希望其他战友如果也有不同于37°C的，请多多跟帖，互相交流。在水中摇动冷冻管的时候水不要浸到瓶盖。* k9 O; c6 V  A

9。在超净台内，瓶盖口应该朝下放。我们知道，用酒精灯的火烧一下，不是为了杀菌，主要是形成向上的气流，防止空气中的细菌落下，如果这样的话，那么瓶盖口向上就不对了，所以瓶盖口应该向下放，但应该注意超净台的酒精消毒。* I9 i3 _7 h7 w4 Q: x- n

作者: hyf198675 时间: 2012-5-2 21:47

回复 cochongg 的帖子% m5 N4 h+ D2 }4 J# S4 J& b
1 t. s# K# m) S, J5 X8 G9 K2 x l8 x
大哥，是原代培养，

作者: hyf198675 时间: 2012-5-2 21:53

回复 jack063@163.com 的帖子4 m3 S; W- Z6 j5 f8 ?) ]/ U, A

我让别人看了下，说是大肠杆菌污染，整个培养皿里全部长满了细菌，太感谢你了！

作者: hyf198675 时间: 2012-5-2 21:55

回复 daviddow 的帖子- q" Y% l* e' |; @9 n& i
* z {2 N" z" p L: M! O8 f9 c
好的，我知道了，谢谢啊！

作者: hyf198675 时间: 2012-5-2 21:58

回复 jack063@163.com 的帖子# ~) G' g9 W$ ?
7 r3 i' D/ i' F7 V+ x
还有，我要排除培养基问题只要做下无菌试验是吗？那胶原酶和胰蛋白酶有没有可能污染啊？能不能做无菌试验？

作者: hyf198675 时间: 2012-5-2 22:36

回复细胞海洋的帖子- l9 @' ~+ m. b1 A0 c! Z' S4 A
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Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h ,加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），是胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30分钟，轻轻摇动。加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.用培养液重悬分离得到的细胞,置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.! 这就是我的培养步骤，

作者: SKC-SFC 时间: 2012-5-3 08:54

原代培养怎么需要那么长时间呢？贴块培养也不需要一周吧。如果是细菌污染的话不需要那么长时间。48小时内就应该可以看到，除非是支原体污染，同时污染的图片应该要留下来的。

作者: tingwuyu 时间: 2012-5-3 10:00

脐带的原代培养确实很容易污染

作者: sdwzg119 时间: 2012-5-3 10:58

回复 hyf198675 的帖子
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原代培养是挺容易染菌的，因为取脐带是产房环境本来就非常差，建议你用双抗水使劲冲，冲6遍以上，并且脐带两头要去掉。

作者: 相宜 时间: 2012-5-3 14:55

回复 jack063@163.com 的帖子5 g5 f7 y( _8 w4 M: ~

非常受用

作者: hyf198675 时间: 2012-5-3 15:33

回复 sdwzg119 的帖子& G3 f( y+ b8 c* F' l; X, |" x6 ^

好的，我试试看，多谢！

作者: hyf198675 时间: 2012-5-3 15:50

回复 SKC-SFC 的帖子
8 x* a, I. j9 K/ v1 Q& [. q3 d; o
我这细胞长得真的很慢，也不知道为什么，刚开始没有污染，是几天前才出现的，48小时内看到的，72小时就全部长满了！想问下你有没有培养过脐带间充质干细胞？有的话能不能指导一下？

作者: hyf198675 时间: 2012-5-3 15:52

回复 sdwzg119 的帖子# t w4 R$ b- L; K

我还有个问题，放脐带的培养基能放很长时间吗？我是把瓶子拿给我同学，有时要放一周左右才能拿到脐带。

作者: jack063@163.com 时间: 2012-5-3 16:57

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如果不考虑成本的话，凡事感觉可能污染的试剂、耗材最好弃用，不想丢就做无菌验证吧。举培养基只是个例子，胰酶等等，包括移液管在操作中只要是怀疑污染---丢弃，启用新的。这是杜绝污染的良方，不知道对你有一定的启示没有？

作者: ontheway_hit 时间: 2012-5-4 10:53

我们养的也是脐带间充质干细胞，原代培养主要是霉菌和酵母菌感染，一般是产妇本身带的病原菌，而分离细胞时又没有加入专门针对真菌的抗生素。细菌污染的情况很少，除非是对多种抗生素均不敏感的院内感染的超级细菌。我觉得注意无菌操作和加入适当的抗生素可以避免绝大部分的污染问题。

作者: hyf198675 时间: 2012-5-4 11:31

回复 ontheway_hit 的帖子; {1 r3 |" b) n7 a! W, ?
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可能是我无菌观念还不强，下次一定注意了，谢谢啊！

作者: sdwzg119 时间: 2012-5-4 16:34

回复 hyf198675 的帖子9 F2 K$ o5 p$ T; d3 x' m

有人是用带双抗和两性霉素B的培养基溶液，应该能存放很久，具体不清楚。我是直接给护士无菌的离心管盛放，马上拿回来处理，一样能行，但是原代总是有染菌率的，不过注意一些也不是太容易染菌。

作者: zarecol 时间: 2012-5-4 16:45

原代培养20天出现污染的话，根据我的经验，我是这样分析的，如果是材料污染那么，原代5天以内就会出现污染物了，20天才发现污染的话我想是你中间换液的问题了，要么操作、要么试剂，如果这两个都没问题的话，在你们操作的环境做下环境监测。看看是否环境不合格。不知道你是哪个地方的，现在天气越来越热了，实验室内环境应特别注意，其次还要注意个人卫生。

作者: 不倒翁 时间: 2012-5-4 17:18

操作和环境是污染的两大来源首先要保证细胞间的大环境干净每天的紫外照射定期打扫操作方面主要就是个人习惯了实验之前拿酒精擦干净超净台和移液器手上要经常喷酒精碰到不该碰的地方的枪头移液管什么的果断扔掉疑似污染的东西尽量都扔掉总之养成好的习惯

作者: hyf198675 时间: 2012-5-4 18:34

回复 zarecol 的帖子' g; a4 z7 C- Y0 j
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言简意赅，受益匪浅，多谢！

作者: hyf198675 时间: 2012-5-4 18:42

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实验室每天都要用紫外线照射消毒吗？实验室多长时间打扫一次？

作者: 不倒翁 时间: 2012-5-4 19:02

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我们的习惯是每天半小时的紫外照紫外的时候关掉空调和通风让臭氧尽量多的留在细胞间细胞间两周彻底打扫一次包括拖地擦桌子超净台冰箱培养箱的门培养箱换水等等一般来说培养箱也要定期擦一下这一点我们做的也不是特别好

作者: 不倒翁 时间: 2012-5-4 19:03

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人多的话超净台大家用完就照一下紫外另一个人再用用之前都会拿酒精擦一下

作者: hyf198675 时间: 2012-5-4 20:10

回复不倒翁的帖子% M3 O% z- _4 u0 E8 F2 [9 H6 V N
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好的，我知道了，因为是新手，所以什么都不知道，刚借了本细胞培养的书在看，谢谢你了！

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