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标题: mouse ips 诱导心肌细胞的方法 [打印本页]

作者: redmaple 时间: 2012-5-8 09:55 标题: mouse ips 诱导心肌细胞的方法

求mouse ips 诱导心肌细胞的方法！

作者: cochongg 时间: 2012-5-8 11:54

将IPS悬浮培养制备类胚体，采用类胚体介导体外自由分化与定向诱导分化（添加RA+DMSO诱导物）

作者: redmaple 时间: 2012-5-8 16:41

回复 cochongg 的帖子8 [4 R; r" J- r+ d5 E. ^6 W; |+ c7 `

能具体点么？

作者: cochongg 时间: 2012-5-8 17:55

1状态好的IPS0 [! C5 ]' M: e9 j$ ^
2早上换液
3四小时后消化
4重悬后转到培养皿上0 s9 b7 m/ q; ^: y8 I4 H
5六十到一百二十分钟沉淀+ |8 O; ~! L6 i9 K( `1 x
6收集悬浮细胞
7重复5、6
8接到普通不帖壁培养皿中
9第二天换液（小心换，细胞没贴壁的）
10两天后吸出囊胚( o3 A+ A! T) t" F) p- \
11接到明胶预先包被的贴壁培养皿中
12三天到五天换一次液2 Y, L! k! m9 k
13不要天天镜检，多看无益- s9 w$ F9 {- E9 L) _
14两周时间内细胞就跳了
) y) p. T a8 f! O) U
注意：培养基一直用无LIF的普通高糖就ok了，血清加15%吧，添加RA+DMSO诱导物（这个要斟酌考虑浓度）# g9 ~; M# P' ^: n# r, N/ f
长得快

作者: cochongg 时间: 2012-5-8 17:55

回复 redmaple 的帖子9 m7 A1 P% Z" k3 N) X

1状态好的IPS) T0 i; A1 T2 E: q1 b5 C5 [2 t- T7 h
2早上换液
3四小时后消化6 R$ U% q% y" [ k6 O
4重悬后转到培养皿上
5六十到一百二十分钟沉淀
6收集悬浮细胞
7重复5、6
8接到普通不帖壁培养皿中
9第二天换液（小心换，细胞没贴壁的）
10两天后吸出囊胚- o/ s' C% a$ J& q+ K$ t3 }3 \/ `
11接到明胶预先包被的贴壁培养皿中
12三天到五天换一次液) S* w" l& E4 o, A3 k
13不要天天镜检，多看无益
14两周时间内细胞就跳了

注意：培养基一直用无LIF的普通高糖就ok了，血清加15%吧，添加RA+DMSO诱导物（这个要斟酌考虑浓度）- V3 K: J: U0 R4 `3 P
长得快/ ^0 S3 R3 t6 L9 ^$ L
" f8 \( c) e5 I( O

作者: cochongg 时间: 2012-5-8 17:56

还要注意一点细胞的状态很重要，成败关键

作者: 细胞海洋 时间: 2012-5-8 23:51

http://www.stemcell8.cn/search.p ... mp;searchsubmit=yes

作者: dymme 时间: 2012-5-21 15:40

回复 cochongg 的帖子0 t% J0 H; t+ j- w) g3 f, V

你好，我想请问一下我们什么时候加诱导剂呢？是制备好拟胚体之后再加呢，还是准备制备拟胚体的时候就加诱导剂呢？谢谢啦~

作者: ligangtiancai 时间: 2012-5-28 00:00

回复 cochongg 的帖子6 W" d+ X; e P) |3 e" S- r

你好，我想问一下是否有必要使用悬滴法制备EB？因为EB的过程比直接悬浮麻烦很多，如果效果类似的话直接悬浮会方便很多，想！

作者: ligangtiancai 时间: 2012-5-28 00:01

回复 cochongg 的帖子
" ^9 K \* Z* H" C9 \, Q
打错，是谢谢！

作者: cochongg 时间: 2012-5-28 00:10

回复 ligangtiancai 的帖子
4 i8 ~' m( e6 O) _
将细胞悬液调整浓度1*10^5个/ml，8 z$ u. h/ X2 S5 X
用多空移液器，30ul每滴5 ~) `; O- [7 k3 u. Y: e
做到10cm培养皿盖上+ d. Y ~ U6 q% P
培养皿中加4-8mlPBS（保湿）6 u2 A- \& c5 W7 l1 I8 i
悬浮培养# K5 w* t3 ?' R- c8 r- F8 e
2-3day收集
转明胶板就ok

注意9 y) a5 H6 T: o& h* o. |% y
细胞状态要好的时候收集8 g: C, v1 m6 M4 u9 T9 u1 j, |
“滴”要尽量圆8 U4 d; _" n. L# k
收集EB要圆中间略黑，不要太黑' ?3 P! ?0 A3 v$ a

作者: ligangtiancai 时间: 2012-5-28 09:08

回复 cochongg 的帖子+ x, M7 n1 v2 B% z8 {4 U

谢谢您的回复很详尽'我这儿还有几个问题：
1 悬滴大小是20ul还是30ul
2 我在做悬滴后移入低粘附版悬浮'但转移时会有很多散开的细胞 : ^. @# l4 W; i4 @
4 悬浮培养后转入明胶版贴壁培养时有很多都不贴壁

作者: cochongg 时间: 2012-5-28 17:55

回复 ligangtiancai 的帖子
/ f2 ]- Q; z' ^4 z
我觉得（仅个人而言）：别人提供的方案自己做总会出现好多问题。
但是我们做事不仅仅是看一个步骤做一个步骤。$ G: R; Q. y* |/ S# v* |; c3 _; y
尤其是做实验，思考是创造的源泉。4 O$ P% X4 o. a, u+ S% @

1做滴目的是悬浮培养，滴做小了（形状不圆，翻转时下垂不足，而且营养不够）你可以衡量一下做一些不同大小的滴，比较一下，形成EB的大小，时间都会不同。你选其优，弃其劣。( n3 i" }" {! w; k" X7 E4 J4 {

其他两个问题都属于正常现象，已经分化的细胞不能形成Eb等，，，具体我也不能做出判断，你可以和你们实验室的前辈讨教一下。

推荐一本入门教程《小鼠胚胎操作实验手册》，，，，不能说很好，书好不好还是看个人悟性。- M; p/ ^1 Z) ~3 E8 B; `6 S
你问的问题太想我们实验室的学生了，，哈哈，，，常常埋头做事，总不停下来思考片刻，! M Z9 m/ M- m9 O/ t$ D0 q/ f
自己设计，验证。这样你的成就感会更大，以后说不定还能发现什么，创造什么，，，，

作者: ligangtiancai 时间: 2012-5-28 23:03

回复 cochongg 的帖子9 q8 n0 t4 L! ]: ]! M+ [4 `. g
* \. |! n$ j# y. o2 U/ Z) w
谢谢，受教了！

作者: ligangtiancai 时间: 2012-5-31 15:25

回复 cochongg 的帖子2 l7 G w- |% ~* A

多谢你的解答，我还有个问题就是EB在做悬滴法诱导时是否需要用ES-qualfied的血清，还是用普通的FBS就行。换句话说，就是用MEF的培养及是否可以做HangingDrop？谢谢！

作者: cochongg 时间: 2012-5-31 21:11

回复 ligangtiancai 的帖子5 n7 u8 a$ K" ]3 T

消化之后的流程一直用，普通高糖加15%的血清，也能成功诱导。
不过我还会加谷氨酰胺，非必需氨基酸（MEF的培养基可不加），2-巯基乙醇...............9 k# E$ N8 U0 t/ W
过滤一下就更好。; N, P7 e/ {, c* \; V6 s. |
也有诱导失败的经历，有次换液忘了预热培养基，后面一直没长好。

作者: ligangtiancai 时间: 2012-6-1 02:12

回复 cochongg 的帖子

是这样啊谢谢！

作者: gexiaoyatou 时间: 2012-10-21 19:44

回复 cochongg 的帖子7 b( w; t+ x& K) X

你好，我想问一下你，这是悬浮培养的方法吗，我做悬滴法好几次都没养出来，而且细胞在15到20分钟后就开始基本都贴了，没法坚持差速贴壁这么长时间呀？最后细胞也不跳

作者: 2006sw0657 时间: 2012-10-23 21:19

回复 redmaple 的帖子3 `& q H5 \! I, w! {1 ~
4 T% T$ K" A3 r; |
请问一下小鼠iPS传代时用0.25%的不含有EDTA的胰蛋白酶消化可以不？如果可以请问可以告诉我具体传代过程吗？还请指示~ 谢谢

作者: 2006sw0657 时间: 2012-10-23 21:20

回复 ligangtiancai 的帖子

请问一下小鼠iPS传代时用0.25%的不含有EDTA的胰蛋白酶消化可以不？如果可以请问可以告诉我具体传代过程吗？还请指示~ 谢谢

作者: 细胞海洋 时间: 2012-10-25 09:46

回复 2006sw0657 的帖子
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