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标题: 错在哪一步，望赐教！------谈脐血分离MSC [打印本页]

作者: 542177563 时间: 2012-5-11 21:38 标题: 错在哪一步，望赐教！------谈脐血分离MSC

具体步骤是：脐血稀释---红细胞裂解液裂解稀释后的脐血---取上清液-----再用密度梯度离心----吸取白膜层（白膜层不是很明显）---PBS洗两便---一部分养在DMEM中想得到MSC，另一部分养在EGM中为了得到EPC（用的是培养瓶，没有铺胶）------可三天后换液（换液时没有发现贴壁的细胞）------换液2天后发现瓶中仍没有贴壁的细胞。结果什么也没培养出来，步骤中哪一步错了，望赐教！

作者: sdwzg119 时间: 2012-5-15 13:25

要说脐血MSC的话，一般是不会每份都能养出MSC的，不过我是听说~没自己养过~据说挺难养~

作者: 壹DD 时间: 2012-5-15 14:48

1.试剂问题，5 I& g8 t: D( q; _9 T4 i6 E
2.方法技术问题。
试问你的细胞敢用临床吗？

作者: Roden 时间: 2012-5-15 16:50

脐血稀释---红细胞裂解液裂解稀释后的脐血---取上清液-----再用密度梯度离心----吸取白膜层（白膜层不是很明显）---PBS洗两便---
楼主详细解释下这两步吧？为什么不直接密度梯度离心？

作者: camus 时间: 2012-5-15 21:10

跟楼上有同样的疑问

作者: nankou2008 时间: 2012-5-16 09:00

做过脐带间充质组织块贴壁慢慢就爬出来了4 r. T+ {5 B% |. T- l' m
脐带血干细胞也贴壁吗？

作者: meister 时间: 2012-5-16 09:01

回复 542177563 的帖子9 ^: \0 x5 ~; U
+ t* n' u! l6 h. l! W. K! l
是ＭＳＣ，EPC都没有吗？

作者: camus 时间: 2012-5-17 09:42

脐血间充质干细胞难道不贴壁吗请问？

作者: hybaoyu 时间: 2012-5-17 16:29

困难重重

作者: 542177563 时间: 2012-5-18 18:52

回复 Roden 的帖子( B. p$ ?6 ?6 Y w( H

这周二又做了一次，干脆把脐血稀释之后直接密度梯度离心，而且离心后也见到白膜层了，但今天还是没有见到贴壁细胞。

作者: 542177563 时间: 2012-5-18 18:52

回复 camus 的帖子, E& i) m$ n6 s* h. t' q( y

没发现有贴壁的，不知道为什么？

作者: 542177563 时间: 2012-5-18 18:53

回复 meister 的帖子
' P+ s+ N0 k' k
这周二又做了一次，干脆把脐血稀释之后直接密度梯度离心，而且离心后也见到白膜层了，但今天还是没有见到贴壁细胞

作者: evial 时间: 2012-5-18 21:30

白膜层放进盘子里时你有没观察过有细胞？红细胞裂解液去除红细胞后要离心沉淀才能收集到细胞啊，取得上清液哪里来的细胞？
要么裂解，要么梯度离心，两个方法同时都用重复了，你有没看过protocal？

作者: joesiezhao 时间: 2012-5-18 21:31

为什么要裂解红细胞呢？裂解后不容易分层，不易观察白膜层。脐血间质干细胞相对来说是比较少的，你要多做几次。

作者: evial 时间: 2012-5-18 21:33

裂解了就不要去分层，不会有分层，上清都是不要的东西，沉淀下来的才是你要的东西，你把孩子当垃圾倒了，当然后来就没有孩子养的出来了

作者: wind789 时间: 2012-5-19 13:47

回复 542177563 的帖子. Q* g7 k9 y9 K& |+ U
2 d7 H2 Q0 J( r
[attach]42239[/attach]我们也正在摸索脐血MSC，推荐一篇文章给你。共同加油！

作者: henryjia 时间: 2012-5-21 03:47

首先，RBC裂解没有必要；直接梯度离心以缩短离体时间；再者，长出细胞克隆一般要8-10天，耐心，淡定。
# R. G' W4 h- H4 F6 s
如果用EGM2培养液提取EPC是一定可以的，脐血EPC比MSC多多了。千万要注意一个问题就是不要因为担心其他细胞污染，就过于频繁换培养液。4 W% w7 m% A( R# K$ N
# s9 \/ I$ u# i$ e9 P% }5 J
祝好运。

作者: Roden 时间: 2012-5-21 10:45

回复 542177563 的帖子

脐血间充质的成功率大概在20%~30%，楼主可以一气儿多养几个。
贴壁细胞呈集落的速度与细胞自身和培养环境都有关系，不知今天爬出来否？

作者: 542177563 时间: 2012-5-21 17:01

回复 henryjia 的帖子( t! h) V/ a- j2 K4 H7 N- z
1 E8 l$ O) Q- ^5 i. ~& D
养EPC是不是一定要铺层？我一般用的是培养瓶，听说瓶底一般有铺层，有时最多用多聚赖氨酸铺一下罢了！这对培养出EPC细胞的影响大吗？

作者: henryjia 时间: 2012-5-22 03:40

回复 542177563 的帖子
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建议铺层，但是我确实实验过不铺层，也一样能长。

作者: Demon_CN 时间: 2012-5-22 09:32

试验前准备。3 j" m& M1 x2 d9 p7 V$ O
个人觉得你要准备经过TC处理过的培养瓶
培养基，L-DMEM+10%FBS（血清里还有丰富的营养，还有促进细胞贴壁的因子这个是以前学长告诉我的，不要问我具体有什么因子）
开始做试验/ H( F3 q' i5 H# V4 F3 p4 @
按照你的操作，我觉得问题不太大& f1 l( D" J; {
具体你的接种密度多少，我接种纯的MSC是1*10^4个/m2 ,不知道那个里面msc的含量，感觉这密度长的最好. R7 q4 q2 C) i
一般第一次贴壁要长点时间到概4-5天，第二次传代2小时就贴壁了

作者: 542177563 时间: 2012-5-23 00:19

回复 henryjia 的帖子+ G6 Z1 G& G$ e+ r8 M, Q' z; A) @
3 Z2 Z# `( U& N6 u8 Y
你指的是取原代时不铺层吗？

作者: 丁丁儿 时间: 2012-5-23 16:37

那请问你见到细胞了吗？就算没有贴壁的，在显微镜下观察应该也能看见细胞啊，再说了，红细胞裂解液本身就对细胞有影响，很可能导致细胞死亡，试着变化一下红细胞裂解液

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