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标题: 关于MEF制备的小疑问 [打印本页]

作者: your1024 时间: 2012-5-13 18:21 标题: 关于MEF制备的小疑问

请问一下，养的MEF里面混有杂细胞，比如上皮样的细胞，还可以用来做饲养层么？如何避免取到杂细胞呢？取胎鼠的时候一只一只的取，总感觉后面的胎鼠在PBS里泡的时间长了，内脏什么的都不好分离了。请教！

作者: cochongg 时间: 2012-5-13 20:47

:L只要没有污染，混有一点杂细胞没问题，应该传下代，或者冻存复苏就不见了杂细胞了。置于你怎样会混进杂细胞，我也不确定，要看你操作过程。1 }7 X8 L3 x3 l3 D) a( ^
但是有种可能是，你取得胚胎太成熟了。细胞分化较为全# W5 r, |6 |" W* J
再说内脏不好分离应该和泡PBS太久没有太大关系，) l8 {1 W# f+ x/ R

或者这样说吧，泡太久确实不利于实验，一般30分钟分离玩15个胚胎速度就算ok。
弯头镊子一夹住就去掉了，宁可牺牲一点，也不要残留内脏。% V# ~; q$ w/ n3 U( E# u0 Z
这个还是：熟能生巧。

作者: cochongg 时间: 2012-5-13 20:48

给你发个步骤参考一下:)6 l: A$ c" U. U' I

1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）7 c ?+ V! W1 [3 D
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵
（2）2：1合笼过夜(雌：雄)* 2 X0 U' e% a+ j7 M: S
（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天
（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料( Y, @( F/ U+ B9 ?) t- L
（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。* r2 V3 T% C& C9 D& y
（6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）
（7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。. T. P& e, s5 o% `0 b3 L# b z
（8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应）
（ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。 i6 F- J, J3 b, y. [+ E- k7 `' {# s. v& B; a6 @
（10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。$ x. J' Z5 v s
（11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）9 P. ^* m; x, K) m" B
（12）第二天换液，随后每2天换液一次。培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。6 s5 ~* C' H/ n" r) v/ F
( j" K- w* `" K) N
要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。9 l( a. }; _! p
要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-13 21:45

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. [1 G( K( Y) f, ^2 D
想问一下，就是一般一只孕鼠一般就是十几个胚胎吧（比如说有12个胚胎），那么去掉四肢，内脏，头以后，一个胚胎里面加多少胰酶（0.25%）呢，是2~3ml吗？如果说12个胚胎的话，是不是要加24~36ml胰酶？可以把所有胚胎都置于一个50ml离心管中，然后一起加胰酶么？还有就是最后终止消化是加多少MEF 培养基呢？最后是用多大的瓶子分装得到的细胞悬液呢？T25还是T75呢？大概能得到多少瓶细胞呢？比如T25瓶

作者: ligangtiancai 时间: 2012-5-13 21:54

回复 huangcong1988 的帖子/ a( h% B2 a$ O7 u

我的经验是： z9 }: U) S, T/ R9 R7 K
去掉四肢、头、内脏和尾巴，将躯干转移至新的培养皿中，加入几滴胰酶，剪切20~30下，然后转入T75 Flask中，按照每个胚胎1ml的量加入胰酶，适度吹打后直立放入37度孵箱消化5分钟，取出后充分吹打后加入MEF培养基终止，按照每个T75瓶2-3个胚胎分装。3~4天后按照1:3传代

作者: cochongg 时间: 2012-5-13 22:52

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:)每个胚胎800-1200mL，终止时用MEF培养基是两倍胰酶体积，50ml的离心管一个就可以容纳。
2个胚胎接一个T75，建议不要用T25接

作者: your1024 时间: 2012-5-13 23:04

回复 cochongg 的帖子$ x9 E+ j& ^/ t) v. D5 @5 n) g

我就是感觉拿镊子夹的时候内脏不是那么容易破出来，所以才怀疑是不是泡久了不好处理了，刚开始的时候是很容易的，时间越长越不好处理。看来还是要多做，多练。

作者: cochongg 时间: 2012-5-13 23:20

回复 your1024 的帖子
# R/ [2 G! G" Q) T8 f
:):loveliness::)

作者: your1024 时间: 2012-5-13 23:21

回复 cochongg 的帖子
/ h; a; W2 ^, @9 A$ H/ C+ f
1、激素处理是必须的么？主要是用什么激素处理？PMSG和HCG？" U9 r, R( C' Q3 D; M1 C
2、消化时间要这么长么？这么长时间会不会对细胞有影响？
3、红细胞裂解也是必须的么？用什么裂解液呢？自己配还是成品？有什么成品推荐呢？
每个胚胎800-1200ml？？可以所有胚胎放在一起进行处理么？一起消化，然后按比例分配？用一个胚胎一个10cm的皿可以么？7 w9 }5 D- R5 V# ^. b6 L9 Z0 X( Q
问题有点多哈！谢谢指教！

作者: your1024 时间: 2012-5-13 23:28

回复 ligangtiancai 的帖子7 h" r7 [5 T4 f4 B: P7 e

请问一下，“然后转入T75瓶”是怎么回事呢？消化后吸到T75瓶里，然后再终止？T75瓶一般要加多少ml的培养液呢？那到P3、P4的时候做成feeder的时候从T75的瓶里转到10cm皿的时候要按什么比例呢？谢谢指教！

作者: ligangtiancai 时间: 2012-5-13 23:38

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% s# l, E F& h2 |* `7 L! D U
1.剪碎后一点点的用滴管转移到T75中，然后按照每个胚胎1ml去补加胰酶（前面剪切的时候只加1~2滴的胰酶）: Z( T! n* S- g7 n
2.放入37度孵箱5min消化，注意T75瓶子要直立。
3. 5min后取出，吹打20~30下
4. 加MEF培养基终止，适度吹打，分装。5 Z; n: \- B8 f& F2 R, y4 t
. N: ?8 x; x" T5 K: T
每个T75加13~15ml培养基
0 Y, ^+ J! G2 u4 w' O) b( k
铺feeder前需要计数，按照3万/cm2（CF-1）或6万/cm2（C57）去铺

作者: cochongg 时间: 2012-5-13 23:39

首先激素处理目的是为了促排卵，能够得到更多胚胎，得到更多同一批次的MEF，确保实验用MEF无差异，以避免MEF批次间差异影响ES生长等等，，，强调一点：胚胎数量不足时，不要将不同来源的胚胎混合。
那个同一胎的可以一起消化，因为是原代组织消化，时间略长，其实也要把握好，' W8 h; i- t' L! Y8 [1 Z: Y) }$ k
置于用培养瓶还是培养皿嘛，主要是控制好细胞密度，都可以

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-14 09:57

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4 `4 Z/ g2 d' S
哦，也就是说一个胚胎大概1ml左右的胰酶？然后终止消化就用2ml左右培养基，那么50ml的离心管还是够的，接到T75瓶里面的话，一个T75瓶里面接多少体积呢？还有消化，冻存的时候需要多少胰酶呢？我们一般用T25,t75比较大，用得少

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-14 09:59

回复 ligangtiancai 的帖子+ i! S% D5 ` ^ C8 s
+ G% S4 T/ w) J# C, ]% L8 m
您是直接将组织在T75瓶里消化吗？这样的话，胰酶跟组织的接触面积大，但是，最后组织块怎么去除呢？

作者: huangcong1988 时间: 2012-5-14 10:02

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您看可以这样不，就是组织剪碎以后，直接加入胰酶（一个胚胎1ml），然后再吸，这样是不是好吸一点？

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