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标题: PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？ [打印本页]

作者: w343989328 时间: 2012-5-30 20:59 标题: PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

请教一下各位老师师兄师姐。; s' H# O# d' J( ?
在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。 ^) z( P" S" l5 D
我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

作者: ying 时间: 2012-5-30 22:36

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。3 u3 e: J" ]. O% W6 g
几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：9 U# M7 Z# d: H( L: a* h- b; S
1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？
2，模板的GC含量如何？
3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？( D, K& J6 g5 V. [
4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？
5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？4 X8 w/ V; M1 o/ b8 K) Q7 w
6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？

作者: flashlab 时间: 2012-5-30 23:52

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

作者: 不倒翁 时间: 2012-5-31 11:22

当然不一样了退火一次只能延伸一次增加退货时间也没有用的引物就那么长一般都用30s就够了增加退货的次数就相当于增加循环数了这样产物才可以变多 GC含量怎么样高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

作者: 冷血粒粒 时间: 2012-5-31 12:13

回复 ying 的帖子7 F+ g1 C  S" Y4 z. ], T

我也有同样的疑问：
1.我的模板是CDNA, Y: b8 a% x$ G7 x& h
2.GC含量62.1%: g5 G2 [7 i7 p: @7 [
3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase
4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min 3 n: T; Z$ E+ p3 g
5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat
   61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg: o2 G$ n2 I% p5 S6 P6 B2 A# A
   121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt9 d1 V& ^0 u0 L5 W: O4 U5 r: ]
   181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt# J/ F6 E5 A, v( o& X! v
   241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga5 O4 v% R4 U$ a5 Y0 e/ P
   301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc% g3 ^- g5 k: g3 }
   361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa+ [) z7 l2 A0 j" B7 v
   421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta
   481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc
   541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg' t& o. R/ K5 z* I9 z. D8 ]' V. ?
   601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata
   661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga. {; `! k1 |+ e! e* m6 A1 h% p1 S
   721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt
   781 agccacatcg cccagcagct cgggctggag aaagacgtgg tccgagtgtg gttttgcaac8 T, x0 i: R0 M% l+ F, K* N$ n
   841 cgtcgccaga agggcaaacg atcaagcagt gactactccc aacgtgagga ttttgaggct
   901 gctgggtctc ctttcacagg gggacccgta tcctctcctc tggcgccagg gccccatttt
   961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct4 X* A! P% ?6 L0 S
   1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac) N+ l  R: j8 P( y
   1081 tga# E8 h5 {* C3 b# r* s0 \' d- H
//  a' u8 b; C8 [$ n
引物$ c/ Y" [- m+ J- b# Q
sense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’0 |: |- e$ l6 R
! ]2 u) [9 }: x( a9 Z9 ]. O- V
antisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA , e7 ~7 k/ }+ T, h0 l
GTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’% r" D. n8 Z5 m1 b. i4 x0 ~. V
引物是加入酶切位点的1 \- w1 W+ Y2 u
6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

作者: lcxlorna 时间: 2012-6-1 08:35

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

作者: 鹤顶宏 时间: 2012-6-1 09:13

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

作者: nankou2008 时间: 2012-6-1 09:46

增加循环次数也不难你试一次不就知道了 2 _; p( U5 _4 X; Q; B* p, d# _$ f
个人觉得延长退火时间不会有作用7 Q5 o: @/ B6 @
我觉得引物最重要是用的现成的引物还是自己设计的
如果是自己设计的还需要多做些摸索评价吧

作者: 刘艳85 时间: 2012-6-1 16:29

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

作者: linzi214 时间: 2012-6-3 10:20

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。

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