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ips诱导和培养中的2个疑问
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作者:
sizhengliu
时间:
2012-6-15 23:09
标题:
ips诱导和培养中的2个疑问
各位大侠！小生有疑问，多多指导：
3 @" F+ Y: ]# s' P: A% J/ i
1，关于血清：在ips的诱导重编程阶段，克隆还未出来之前，这段时间可以使用胎牛血清吗？（gibco的澳洲血清）这对感染后细胞的增殖有无帮助？对克隆的出现和形成有无负作用？
* ^2 b# r- z0 f1 k7 f
2，关于筛选：在细胞感染病毒后，需不需要进行药物筛选？在克隆形成后，需要怎样筛选合适的克隆进行扩增？
. T9 x, f1 u( C3 ~9 E
作者:
frankieisme
时间:
2012-6-16 02:22
1.诱导重编程阶段中血清是必须的;
8 X1 \+ C: g2 p2 ~: S: D
2.在细胞感染病毒后，需要G418和嘌呤霉素筛选各一次,在克隆形成后不需要筛选.
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-16 08:22
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frankieisme
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5 T, U5 P! ^6 n2 W2 l+ h
& g: p; ?# b( P5 \
1.克隆未出现之前一直需要血清么？不是感染的时候（两到三天时间）含血清，之后换干细胞培养基么？
- I0 D4 C/ y7 _4 Y: b, J# C' |
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-16 08:23
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frankieisme
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/ ]6 ]6 I5 c( L5 R
/ b9 q5 m" L' y) W3 p
还有就是，血清的作用机理？
作者:
sizhengliu
时间:
2012-6-16 20:51
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frankieisme
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. K2 {9 `5 y8 j
7 G4 c- B. o. L% E0 E1 }
1,胎牛血清最晚可以用到什么时候换?
3 X- I( G6 G3 c1 R
2，感染后，嘌呤霉素筛选可以终止的条件是什么？
5 l0 O8 B9 \8 C! V/ _8 i5 t) v: D
谢谢！
作者:
frankieisme
时间:
2012-6-18 22:47
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sizhengliu
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( n' s5 s" r2 N# e# r2 Q! f1 X
5 H/ c+ W- s, A
不管是FP medium或者ES medium都含血清,只不过前者是10%,后者是15%;
; v! i. G, K5 E6 Q
嘌呤酶素一般在G418筛选后第4天用,只用一次,之后就每天更换新鲜的ES medium,等到克隆长出来.
作者:
frankieisme
时间:
2012-6-18 22:48
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huangcong1988
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* \! K# d0 A1 x+ {8 B7 t
8 I- Y5 [' ]; ?
ES medium中也含有15%的血清啦.
作者:
zmm
时间:
2012-6-18 23:24
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sizhengliu
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2 V: m) [- Z. |/ [. P2 k; W1 n
$ h7 X0 m+ J" B' y
您的细胞是什么物种的？细胞感染后我一般不筛选，而形成克隆后，用活细胞染色进行筛选！
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-19 09:13
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frankieisme
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! U O5 v8 z$ x; f7 r _7 R% w# j
u {7 N$ i6 m; {8 ]
您是养小鼠的吧？
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-19 09:13
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zmm
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" l; J) F* O: c% n
8 K1 ^; c. P! p- Z# z7 Z* f+ y( V
染色之后克隆还能用么？
作者:
zmm
时间:
2012-6-19 11:13
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huangcong1988
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+ }7 _2 K, b% o
1 }! B% e% L5 b. Y
是活细胞染色，对细胞没有影响，换液即可。
作者:
sizhengliu
时间:
2012-6-19 15:23
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zmm
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* p8 K$ G( B9 Q; {8 u( V* ^0 b: s
6 n2 ^7 X' v& f- K% n
我是人源的细胞。
7 d& ?% N1 T+ D* O
你的感染率有多少？你的细胞在感染后到克隆形成，这段时间需要传代吗？
作者:
zmm
时间:
2012-6-19 22:00
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sizhengliu
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5 v, b# W0 Q; L
0 f; b( A+ n* s2 l4 k) x7 \2 h
感染效率应该是要达到100%。需要，感染后的细胞长满后要穿到feeder上
作者:
sizhengliu
时间:
2012-6-19 22:45
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zmm
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# [# `& t, U3 N, J9 M
" O+ C) z3 W% ]5 Z
感染率达100%，那么为什么还要抗选呢？
作者:
sizhengliu
时间:
2012-6-19 22:48
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frankieisme
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! y W' v5 B' O! T3 _
" L5 ^6 O: H, D- n1 c( v- F4 w8 o9 a8 ~
不明白：你用G418后又用嘌呤霉素？是你的质粒2种抗性都有吗？
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-20 18:45
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zmm
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* k+ r# e; o) u& D) e& ^
3 Y2 r( d; G/ T/ p: O
哦，那不错，AKP，完了之后洗掉？
作者:
zmm
时间:
2012-6-20 20:58
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huangcong1988
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( [1 G0 p* C7 v, V5 S
! _& ]! L! [# `
AP是不是活细胞染色吧？要然ssea-3/4
作者:
zmm
时间:
2012-6-20 20:59
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sizhengliu
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& o& }$ M( }. M0 _6 K
" }: r8 J! h* l* J
进行筛选重编程完全与不完全的克隆
作者:
sizhengliu
时间:
2012-6-21 01:44
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zmm
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) |2 b, J% ], n/ G% S+ r
1 z) j- I& ?! L7 O' I4 \5 Z
筛选克隆是靠染色，筛选感染细胞是靠药物。不明白的是：你用G418后又用嘌呤霉素？是你的质粒2种抗性都有吗？
作者:
zmm
时间:
2012-6-21 09:16
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sizhengliu
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+ C) O" _% Q( N# V
& Y# H' }: o7 I
我感染的细胞不筛选。也不是筛选克隆，只能用火细胞染色，辨别一下那些事好的克隆。
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-21 09:51
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zmm
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: Y$ B& {2 Q, Y) N7 a) J
4 G# [% l* I7 G: S4 I2 v
？请明示
作者:
zmm
时间:
2012-6-21 09:56
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huangcong1988
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! I! _$ J) t. {( X
9 [. z2 b9 l3 m& k- L5 X
刚才的错别字太多了，不好意思。就是说感染后的细胞我一般是不筛选的。就是形成克隆后，你不能辨别哪些是重编程完全的克隆，这时你就可以进行一下活细胞染色。
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-21 09:58
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zmm
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/ S! y0 Y# I3 c( X. J
4 e- ~# G, z( Z& o, Y
哪些？活细胞染色？
作者:
zmm
时间:
2012-6-21 10:14
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huangcong1988
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6 N! _+ s' e) L: }/ V
/ W" b0 I& F- D
活细胞染色，就是染人胚胎干细胞特异性的marker，seea-3/4。只有表达这些marker的克隆才可能是重编程完全的克隆，才有可能进行传代下去
作者:
huangcong1988
时间:
2012-6-21 10:43
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zmm
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8 q4 l! k$ h# e( [/ I; k3 `' D9 T
) T0 n0 h7 L8 c
染色后PBS洗就OK了？
4 F x& W* ?% B9 E
那AKP呢？
& h- H+ A1 M) W/ x
用AKP鉴别之后不是colony全死掉了？
作者:
franklinhg
时间:
2012-6-21 10:45
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huangcong1988
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x8 @0 }/ j. e. j7 S- T4 P
$ Y9 g9 I- a) c( h8 |( C9 A
Life 公司有可以活体染色的ALPkit , so it is not impossible.
作者:
zmm
时间:
2012-6-21 11:31
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huangcong1988
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! P U7 A4 k: h) Y) [' Y/ U, t
+ u' c. e% Y1 x* C7 g: v
不是做AP，AP不是活细胞染色，要用活细胞染色的抗体。
作者:
frankieisme
时间:
2012-6-21 23:30
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sizhengliu
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! _" ?7 \, @6 G$ l/ Q o
) n8 D6 _' b- {; t& c
是的
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