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标题: 有没有做过RNA-IP 的？ [打印本页]

作者: markllq 时间: 2012-6-19 17:33 标题: 有没有做过RNA-IP 的？

求助：有没有做过RNA-IP 的？我用一个抗体（cell signaling）和IGG（abcam）做的RIP，最后提完RNA（RNA 的总量差不多），做完反转，然后做QPCR，来检测我想要的mRNA的变化。用ACTIN 作内参，发现 actin 的ct值分别是 26（抗体）和23（iGG）, 检测的MRNA 的ct 值差不多都是29 ，这有没有问题？是否说明了我拉下来的mRNA是IGG的8倍？

作者: xyz007 时间: 2012-6-19 21:05

您好！这个内参差别那么大，而你要检测的mRNA却没有变化。不好说啊。想问一下你孵育完了是怎么处理的啊？先用RNA酶抑制剂什么的吗？

作者: markllq 时间: 2012-6-19 22:37

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我用的就是nature protocol 上的方法。RIP-Chip: the isolation and identification of; t U$ L+ y% c* v( ?- I' |3 F% \
mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts 。9 S0 _+ e$ m5 m1 L
孵育完后用NT-2 buffer + PK 酶消化RNA ，然后用 Trizol reagent 提取RNA。 NT-2 buffer 中没有加入RNA 酶抑制剂。

作者: xiphias 时间: 2012-6-19 23:20

回复 markllq 的帖子0 u7 L9 x! ^$ T% t

如果起始细胞量一致，只能说明实验失败啊。actin变化太大了。

作者: xyz007 时间: 2012-6-21 09:48

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那你做的实验组的抗体和RNA你确定他们有相互作用了吗？是已有文献报道了没有啊？如果没有，我觉得你有必要做对照呀

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