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标题: hiPS传代时的消化问题 [打印本页]

作者: 573639471 时间: 2012-6-21 16:19 标题: hiPS传代时的消化问题

今天传代用胶原酶消化30min后 feeder全晃下来了，iPS继续消化了20min也下不来 0 _' n5 |7 C } d& _% w( B+ L8 H
酶是刚配的sigma粉末 1mg/ml
怎么回事，大家遇到过吗

作者: 573639471 时间: 2012-6-21 16:30

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有图为证

作者: 开心果王 时间: 2012-6-21 17:49

貌似feeder有些密啊，看到你的克隆消化后都散掉了，这样传代效率不高把！可以不用消化这么久，看到有些卷边就可以用枪头刮下来了！

作者: wwy551 时间: 2012-6-21 20:49

消化确实太久了，这样对ips克隆不好，我们都很少等克隆自己脱落的，一般消化5到10分钟就可以用1ml的移液管刮克隆了

作者: fguw 时间: 2012-6-22 06:46

酶是刚配的sigma粉末 1mg/ml' ？
我觉得你配的有问题，你用PBS，还是DMEM/F12 配的？
不会是培养基吧？4 J* K$ k1 [3 X7 P( V0 P+ _- R
应该用DMEM/F12

作者: wang3033 时间: 2012-6-22 07:12

feeder是用鼠尾胶原制备的，消化当然没有问题，IPS细胞团之间的连接不是靠胶原蛋白连接，所以细胞团散不开，其实你的胶原酶没有问题，而且消化已经过头了

作者: 白巧克力 时间: 2012-6-22 09:17

你的feeder layer好密啊... ... 我买的不是sigma的，不知道大家用的是不是都是；而且我发现，用没用完的collagenaseIV（用剩冻起来再化开用）消化会比新的慢些。

作者: 490096812 时间: 2012-6-22 09:29

我觉得可能是你的胰酶有问题，是不是有血清污染了啊

作者: BNJN 时间: 2012-6-22 11:38

我用的是Dispase，消化5min左右，再用枪吹下来。

作者: zmm 时间: 2012-6-22 13:23

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4 r' v3 I0 a) n& t
我觉得你的feeder太密了，这样会导致你hips状态不好。依我看你那克隆大小不用传代，可以在培养两三天。消化的时间基本在5min就可以了。还有你这个是人源的feeder吧？

作者: stemcellmeng 时间: 2012-6-23 17:12

如果iPS消化的时间比较长还下不来，就有可能是分化了。

作者: 573639471 时间: 2012-6-24 08:49

回复 fguw 的帖子: D$ ?+ Q7 O' s# U6 u& ~+ ?
: D% W. S6 |; Y
用PBS配的

作者: 573639471 时间: 2012-6-24 08:50

回复 zmm 的帖子0 `* I" P# i |0 u$ {+ h
: {/ @0 y& q4 {7 P, r9 W/ b
iPS是人的，feeder 是鼠的

作者: 573639471 时间: 2012-6-24 08:50

回复 BNJN 的帖子) |; p! }4 J+ A! k$ a' c- c
R7 w: D, q- t
不会吹散吗

作者: 573639471 时间: 2012-6-24 08:52

回复白巧克力的帖子

你买的是哪公司的？好用吗用DMEM/F12配的？

作者: BNJN 时间: 2012-6-25 08:56

Gibco的，我实验室的hiPS、hESC传代都用，5min后看见克隆边缘有卷起就行了

作者: 白巧克力 时间: 2012-6-26 08:42

回复 573639471 的帖子 j2 o; s& R% L; c
* k. e/ J1 ^1 ~/ V0 L! t2 N& Y
Gibco的，具体与楼上BNJN相同。

作者: 573639471 时间: 2012-6-26 14:57

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配的有什么问题？除了不应该用PBS还有吗

作者: fguw 时间: 2012-6-27 15:35

比较标准的是，DMEM/F12（1：1）1 q5 ^1 R1 N6 L v8 R, y
因为基础培养基就是这个，5 ~( W8 x1 L2 w
我们实验室做过实验，发现这个最好，

作者: 也行天下 时间: 2012-8-10 16:16

feeder太密了！iPS克隆中间的细胞好像已经有分化了吧，这可能也是iPS克隆消化不下来并且细胞较散的原因吧。
我们用胶原酶消化一般40-50分钟至iPS克隆明显卷边，即使克隆完全消化下来了细胞也不会像图中的那样散。, x# E4 C) v5 ]! b

作者: gexiaoyatou 时间: 2012-10-19 22:37

回复 BNJN 的帖子5 l w) V6 w+ u. Q7 @5 H5 q

是哪个公司的dispace，可以推荐下吗？大体消化到什么程度呀？

作者: 第一心音 时间: 2012-10-20 13:45

建议直接挂下来

作者: jcb 时间: 2012-10-21 02:43

为啥不在胶上养。便宜很多。传代，dispase 比较好。消化六七分钟，洗三遍然后用玻璃移液管切成小片。: \; E$ C1 f8 I6 v' b/ E4 w% b5 i

作者: fwj81 时间: 2013-1-21 16:58

饲养层好像密了点，我们用0.05的胰酶消化5分左右就好了，且传代生长很好呀，检查下是不是哪个环节出问题了

作者: Jonathan 时间: 2013-1-23 11:34

问题很多啊。1 feeder 太密，2 克隆形态太差 3 消化时间过度 4消化后是用枪头或者啥的刮下来

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