我们知道，PeproTech的所有细胞因子和蛋白均为冻干粉，这使得运输非常便捷，只要常温即可。而且，细胞因子和蛋白冻干粉非常稳定，在-20℃或-80℃条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，然后以液体形式加到培养体系或注射入动物体内。溶解步骤非常关键，因溶解不好会导致细胞因子或蛋白的失活，这也是很多用户在实际使用中经常遇到的问题。, I5 O; F w0 C. x, V& Z! {( I
x; k8 e( d! ~9 t8 f那么，应该如何进行正确的溶解呢？) u& [ L9 R: p' U
, [; t) I' \& R7 f, _+ y下面我们以Recombinant Human IL-4 (重组人IL-4，产品编号：200-04)的说明书为例，对细胞因子或蛋白的溶解方法进行详细的阐述。 + N1 g# t3 z# F1 T q" C . X6 i1 o1 m8 ~: p( D4 t( h( g7 _
拿到重组人IL-4的说明书后，您会发现有一段关于Reconstitution(重悬)的叙述，这段内容含有溶解相关的所有信息。 4 c# W2 F' M7 R/ W; J, w 2 q! N2 e( ^; T: T: c( y1. Centrifuge the vial prior to opening.0 v8 X$ w# }. c4 n! W9 |+ v
第1步：开盖前离心试剂管- d" c* Q/ o' Z* u$ M& X; n1 a
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PeproTech的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中，为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上，所以在打开塑料瓶盖前，需将冻干粉通过离心收集到管底，以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。, ]3 b; [" N" _2 n6 U* f3 ]
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有很多用户会问一个问题，即应该用多少转速、多长时间离心试剂管，才能达到良好的收集效果？ / p1 E) T* r+ k5 U. z6 M1 }0 Q答：有些小型高速离心机(多为进口品牌)的面板上有一个Spin键，按了此键后，离心机会自动快速上升到其最大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到最高点后速度即刻下降，直至停止旋转，整个过程大约30s。这个Spin键足以很好的将细胞因子或蛋白收集到管底。4 \7 W& m% k: |# }% S
& v' W; K- ?+ L/ Y$ K) b但有些实验室没有这样的高速离心机，只有最高转速为4000-4500rpm的离心机。这种情况下，需3000-3500rpm离心5min，也能达到类似的效果。 0 P0 d, x& c" o0 P : r$ [2 O* Z/ m% Y; x- O4 }
2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex." ^" e/ C7 v5 V6 b* Y$ d
第2步：用无菌水重悬至0.1-1.0 mg/ml，不可振荡。7 n6 A! c$ Q1 e, F
; n/ B4 L4 U( x+ t0 s这个步骤即为溶解步骤，非常重要。 3 H: m$ F$ T; {. W- b! B) p9 M. ? * i3 W$ e+ T0 m7 b- u1) 一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉9 T4 l d1 g/ h' s1 \ Q) V
' @1 ?8 h6 h9 g, l* D) o" u9 k' T' ^蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性，这个范围就是说明书上所标明的浓度范围，该例为0.1-1.0 mg/ml。这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。如重组人FGF-6(产品编号：100-30)为0.5-1.0mg/ml，而重组人Activin B(产品编号：120-15)则一定要是0.5mg/ml。 $ D/ k, d# }6 g+ C2 M/ O ! {6 a9 E% R* f6 u* O& P, v高于或低于该浓度范围会有什么问题呢？ 8 R# k- }/ z8 Z, E( f答：首先，细胞因子或蛋白会不稳定，即很容易出现活性下降的现象。其次，高于这个浓度范围，可能会超过该蛋白的最大溶解浓度，即蛋白无法完全溶解。再者，高于或低于该浓度范围，蛋白可能会出现聚集(aggregation)，最终结果还是部分蛋白未溶解，导致蛋白活性的减弱。 0 C- }- H6 T0 ], w/ x w - w6 {' M2 ?, e9 k2 |3) 一定不能振荡(vortex)。 0 p9 W' U$ M1 C& s2 q8 e# @# d 9 F7 L! U: S6 A6 r) X0 |这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。 ) w8 V" d$ Y8 A+ a ( a" q# s) L% J' S9 V+ W- a# m有用户会问，若想保证溶解液与冻干粉充分混匀，以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解，该怎么办呢？ - H) X" _/ @9 R8 `$ u4 a5 ?答：多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的，一般我们用移液枪的枪头轻吹几下，即可使细胞因子或重组蛋白完全溶解。 . g, j% f9 G6 f6 g" c f5 c% i1 e7 J" N7 E
对于不易溶解的细胞因子或蛋白，PeproTech会在说明书中进行备注(Note)。如在重组人IL-13(产品编号：200-13)的说明书中您会看到：Slow to dissolve (缓慢溶解)，在重组人IL-11(产品编号：200-11)的说明中会看到： This solution is slow to dissolve.(该溶液溶解缓慢)。这种情况下，您最好能将要溶解的细胞因子或重组蛋白放在水平摇床(shaker)上低速摇一段时间，促使细胞因子或重组蛋白完全溶解。 5 ?+ l% v" h, x3 i1 l0 h* ~ / ^8 c" H. q6 |; A" I有些蛋白，如重组人IL-13 Variant (产品编号：200-13A)虽然难溶，但却不需用摇床来加速溶解。其说明书上的备注为：Allow the reconstituted vial to sit at 4℃for at > 2 hours before use. (将重悬液在4℃静置2小时以上)) M/ [4 O h( e2 _1 n7 m% ]
S' z9 C, {4 O i X3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1 week. 4 J+ P$ R: M k& L6 b- j" \第3步：该重悬液在2-8℃最长可保存1周。 + I" n7 ^1 Y( I! K / P4 ?, }' h( ^) H1 @
用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后，细胞因子或重组蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在这种条件下，细胞因子或重组蛋白的活性最长可保持1周。这对一个周期为5-7天的实验，如DC(树突状细胞)的诱导成熟是足够的。在此期间，只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白溶液加入到培养体系内即可。+ Q: Q% b! P3 P
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其实，说明书上推荐的浓度对于一般的实验来讲是比较高的。所以用户通常会将该溶液进一步稀释后再放在4℃保存，待1周内用完。如进行稀释，必须遵照下面第4步的方法，即需用含载体蛋白的溶液进行稀释，否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很容易会粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的细胞因子或重组蛋白的浓度下降，细胞因子或重组蛋白的总活性则大为减弱。! z& H- d* v* O" z* R' y: l; h
5 Y8 z( L1 i' C4 G% |5 t) p }4. For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃to -80℃. 1 w3 i% p: u \$ ^$ f第4步：如要长期保存，则需用含载体蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃。! S6 T, U1 q. K9 \3 H1 ?
3 k8 K& `# @; m0 M& K1 E$ c$ I如果一个实验周期长于一周，或配制的细胞因子或重组蛋白一次用不完，我们就需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。方法是：将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液将重悬液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃，即常规冰箱的冷冻室或超低温冰箱中。 + W# L# Z/ w0 m) x. E E * L" h7 e: Z- U5 k* E
经常有人会在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后直接分装冻存于-20℃至-80℃，这样可以吗？ # I5 y7 _2 f7 Y答：不行。我们知道，塑料管壁对多数蛋白均有很好的吸附作用，也就是说溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很难与管壁分离的。做过ELISA实验的人都知道，ELISA的包被抗体(Capture antibody)就是通过这种粘附作用包被到酶标板上的。/ L. ]$ v( d3 @% Y9 B$ H/ e5 T) M